DOC《HPLC培训教程》

大分子量的化合物不能进入孔中,直接随流动相流出.它利用分子筛对分子量大小不同的各组分排阻能力的差异而完成分离.常用于分离高分子化合物,如组织提取物、多肽、蛋白质、核酸等. 被分离组分在柱中的洗脱原理 II.基本概念和理论

一、基本概念和术语 1.色谱图和峰参数 ?色谱图(chromatogram)――样品流经色谱柱和检测器,所得到的信号-时间曲线,又称色谱流出曲线(elution profile). ?基线(base line)――经流动相冲洗,柱与流动相达到平衡后,检测器测出一段时间的流出曲线.一般应平行于时间轴. ?噪音(noise)――基线信号的波动.通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致. ?漂移(drift)――基线随时间的缓缓变化.主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起,柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移. ?色谱峰(peak)――组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线.流出曲线上的突起部分.正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线(高斯Gauss曲线).不对称色谱峰有两种:前延峰(leading peak)和拖尾峰(tailing peak).前者少见. ?拖尾因子(tailing factor,T)――T=,用以衡量色谱峰的对称性.也称为对称因子(symmetry factor)或不对称因子(asymmetry factor).《中国药典》规定T应为0.95~1.05.T1.05为拖尾峰. ?峰底――基线上峰的起点至终点的距离. ?峰高(peak height,h)――峰的最高点至峰底的距离. ?峰宽(peak width,W)――峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离.W=4σ ?半峰宽(peak width at half-height,Wh/2)――峰高一半处的峰宽.Wh/2=2.355σ ?标准偏差(standard deviation,σ)――正态分布曲线x=±1时(拐点)的峰宽之半.正常峰的拐点在峰高的0.607倍处.标准偏差的大小说明组分在流出色谱柱过程中的分散程度.σ小,分散程度小、极点浓度高、峰形瘦、柱效高;

反之,σ大,峰形胖、柱效低. ?峰面积(peak area,A)――峰与峰底所包围的面积.A=*σ*h=2.507 σ h=1.064 Wh/2 h 2.定性参数(保留值) ?死时间(dead time,t0)――不保留组分的保留时间.即流动相(溶剂)通过色谱柱的时间.在反相HPLC中可用苯磺酸钠来测定死时间. ?死体积(dead volume,V0)――由进样器进样口到检测器流动池未被固定相所占据的空间.它包括4部分:进样器至色谱柱管路体积、柱内固定相颗粒间隙(被流动相占据,Vm)、柱出口管路体积、检测器流动池体积.其中只有Vm参与色谱平衡过程,其它3部分只起峰扩展作用.为防止峰扩展,这3部分体积应尽量减小.V0=F*t0(F为流速) ?保留时间(retention time,tR)――从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间. ?保留体积(retention volume,VR)――从进样开始到某组分在柱后出现浓度极大值时流出溶剂的体积.又称洗脱体积.VR=F*tR ?调整保留时间(adjusted retention time,t'

R)――扣除死时间后的保留时间.也称折合保留时间(reduced retention time).在实验条件(温度、固定相等)一定时,t'

R只决定于组分的性质,因此,t'

R(或tR)可用于定性.t'

R=tR-t0 ?调整保留体积(adjusted retention volume,V'

R)――扣除死体积后的保留体积.V'

R=VR-V0或V'

R=F*t'

R 3.柱效参数 ?理论塔板数(theoretical plate number,N)――用于定量表示色谱柱的分离效率(简称柱效). N取决于固定相的种类、性质(粒度、粒径分布等)、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质.如果峰形对称并符合正态分布,N可近似表示为: N=()2=16()2=5.54()2 N为常量时,W随tR成正比例变化.在一张多组分色谱图上,如果各组分含量相当,则后洗脱的峰比前面的峰要逐渐加宽,峰高则逐渐降低. 用半峰宽计算理论塔数比用峰宽计算更为方便和常用,因为半峰宽更易准确测定,尤其是对稍有拖尾的峰. N与柱长成正比,柱越长,N越大.用N表示柱效时应注明柱长,如果未注明,则表示柱长为1米时的理论塔板数.(一般HPLC柱的N在1000以上.) 若用调整保留时间(t'