DOC《ELISA实验操作中常见问题有哪些：》

而利用基因工程制备的抗原,分子量更大. b.稳定性好.包被的抗原的稳定性可使 试剂盒的效期得到保证,早期以合成肽为包被抗原的 试剂盒效期只有3-4 个月,采用基因工程抗原后效期大大延长了. c.基因工程抗原将特异性抗原决定簇基因融合表达,表达产物包含更多的抗原决定簇,可提高 试剂盒的灵敏度,提高检出率. d.纯化难度大.基因工程抗原的纯化技术难度较大. 合成多肽抗原是根据蛋白质抗原分子的某一抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段.合成肽抗原有以下特点: a.分子量太小;

b.一般只含有一个抗原决定簇;

c.纯度高;

d.稳定性差. 国内乙肝两对半试剂厂家较多;

不同厂家出产的试剂灵敏度与特异性存在一定的差别,资料显示,不同厂家试剂的特异性和敏感性分别为 89.4%―99.3%,78%―89%存在较大差异.有的厂家酶标板孔间A值差大于15%;

标记酶的活性及显色液的稳定比较差.使用质劣的试剂必然导致结果的假阳性或假阴性.因此.选择高质量的试剂是保证结果准确的关键之一. ? 选择试剂时应选择灵敏度高、特异性好、稳定性好、批间差小、操作方便省时的优良检测试剂,国家参比实验室每年对各厂家的试剂进行质量评估并定期公布评估结果,可作为选择试剂的主要依据. ? 要注意试剂的批号和出厂日期,虽然试剂的有效期多为 1年.最好选择刚出厂的试剂使用. 不同厂家的试剂不能混用. 不同方法学的检测试剂,会使两对半结果出现一些不同.例如:在实际工作中常用 ELISA检测HBsAg结果为阴性,而电化学发光检测为阳性.除方法学的灵敏度外;

还存在使用单抗或多克隆抗体试剂的差别.单抗对变异抗原或亚型乙肝标志物检测存在差异,建议试剂厂家对剂的制备应该考虑亚型及型浓度的问题.

3、操作技术的影响 操作过程的控制: ⑴ 严格按照试剂说明书进行操作.操作前将试剂在室温下平衡30~60min. ⑵ 加样后及时放人孵箱.标本较多时,要分批操作.按说明步骤严格控制操作时间,防止孵育时间人为延长,导致非特异性结合紧附于反应孔周围,难以清洗彻底. (3)封板温育时,各孔一定要封严,防止阳性标本的液体蒸发,产生周边现象从而导致 花板 的出现. (4)用洗板机洗板时,保证洗液注满各孔,洗板针畅通,洗完板后最好在吸水纸(选择干净、无或少尘的吸水材料)上轻轻拍干:还要防止针口有纤维蛋白或异物,这些异物在洗板的过程中易产生拖带现象而导致 花板 的出现. (5)合理安排检测量,以免反应板过多造成洗板等待时间长. (6)加酶试剂后用吸水纸在酶标板表面轻拭吸干. (7)显色剂尽量在临用前配制,坚持不用过期显色剂,肉眼可见浅蓝色的TMB显色剂不用. (8)加样时保持显色剂不外流;

A、B液应避免接触金属器械.加终止液时应避免产生气泡. (9)应保证酶标板清洁,整个操作过程中保证酶标板不接触次氯酸.以上的措施可以使 花板 降至最低限度.从而提高检测的特异性.并得到更准确、可靠的实验结果. 加样吸嘴的洁净与否和吸量的准确性,直接影响检测结果.由于吸嘴构造特殊,导致清洗困难,加大了交叉污染的机会.建议用一次性吸嘴.加样器也要经常清洗,定期校准.加样时应将所加物加在 ELISA 板孔的底部,避免加在孔壁上部,并注意不可溅出. 温浴影响,在建立 ELISA 方法作反应动力学研究时,实验表明,两次抗原 抗体反应一般在37℃经1-2 小时,产物的生成可达顶峰.为避免蒸发,板上应加盖,也可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔,反应板不宜叠放,以保证各板的温度都能迅速平衡.应注意温育的温度和时间应按规定力求准确.由于公司的 试剂盒温育是在空气浴中完成,采用水浴会造成值偏高或花板.另外温育中还有边缘效应,边上的值会偏高,建议为了客观的判断结果,将质控放在非边缘位置.96孔酶标板结构特别;