DOC《ELISA实验操作中常见问题有哪些：》

易产生边缘效应,抗原抗体结合及酶促反应对温度有严格要求,酶标板周围与内部孔升降温速率不同,造成周边与内部孔结果差异;

干浴与水浴存在明显的差异,尽可能使用水浴,并要求固相板放入水中,减少受热不均,贴密封膜,防止污物浸入. 洗涤在 ELISA 过程中虽不是一个反应步骤,但却决定着实验的成败.ELSIA 就是靠洗涤来达到分离游离的和结合的酶标记物的目的.通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质,以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质.聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的,而在洗涤时应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来.可以说在ELISA 操作中,洗涤是最主要的关键技术,应引起操作者的高度重视,操作者应严格按要求洗涤,不得马虎. 洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液,各种 试剂盒的洗液不要混用.聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的,非离子型洗涤剂既含疏水基团,也含亲水基团,其疏水基团与蛋白质的疏水基团借疏水键结合,从而削弱蛋白质与固相载体的结合,并借助于亲水基团和水分子的结合作用,使蛋白质回复到水溶液状态,从而脱离固相载体.洗涤液中的非离子型洗涤剂一般是吐温20,其浓度可在0.05%-0.2%之间,高于0.2%时,可使包被在固相上的抗原或抗体解吸附而减低试验的灵敏度.洗液需要稀释,应按要求稀释.配制洗液应用新鲜的和高质量的纯化水,电导率小于1.5μs/cm,洗液如果结晶应待其融解后配制.手洗条件一致性较差,对结果影响较大,防止洗液在孔内形成气泡.半自动与全自动冼板机使用不当也会影响结果,血清中残留的的纤维蛋白丝或洗涤液析出的结晶易使洗板机针小孔全阻塞或半阻塞状态,造成未结合标记酶洗脱不彻底,导致 花板 造成假阳性或假阴性;

所以操作洗板机过程中要不时观察洗板机针孔内洗液的通畅状况,及时纠正,洗板机不用时应用去离子水清冼几遍. 保证洗板浸泡时间为

40 秒左右,孔内液体被洗板机吸得越干净洗涤效果更好,手工洗板 4.显色和比色 TMB 经HRP 作用后,约40 分钟显色达顶峰,随即逐渐减弱,至2 小时后即可完全消退至无色.TMB 的终止液有多种,叠氮钠和十二烷基硫酸钠(SDS)等酶抑制剂均可使反应终止.这类终止剂尚能使蓝色维持较长时间(12-24 小时)不褪,是目视判断的良好终止剂.此外,各类酸性终止液则会使蓝色转变成黄色,此时可用特定的波长(450nm)测读吸光值.酶标比色仪简称酶标仪,通常指专用........