DOC《附件1》

附件1 ICS NY 中华人民共和国农业行业标准 NY 主要农作物品种真实性SSR 分子标记检测 普通小麦 Variety genuineness testing of main crops with SSR markers―Wheat (Triticum Aestivum L.

) (征求意见稿) 发布 实施 中华人民共和国农业部发布 目??次前??言II

1 范围

1 2 规范性引用文件

1 3 术语、定义和缩略语

1 3.1 术语和定义

1 4 总则

2 5 检测方案

2 5.1 总则

2 5.2 检测平台

2 5.3 引物

3 5.4 样品

3 5.5 检测条件

3 6 仪器设备、试剂和溶液配制

3 6.1仪器设备

3 6.2 试剂

4 6.3 溶液配制

4 7 真实性检测程序

4 7.1引物合成

4 7.2 DNA提取

7 7.3 PCR扩增

7 7.4 扩增产物分离

8 7.5 数据分析

9 8 结果计算与表示

10 9 结果报告

10 附录A (规范性附录) 溶液配制

11 附录B (规范性附录) 等位基因扩增片段信息

13 前??言 本标准依据GB/T 1.1-2009 给出的规则起草. 请注意本标准的某些内容有可能涉及专利.本标准的发布机构不应承担识别这些专利的责任. 本标准由中华人民共和国农业部提出. 本标准由全国农作物种子标准化技术委员会(SAC/TC37) 归口. 本标准起草单位:北京市农林科学院北京杂交小麦工程技术研究中心,全国农业技术推广服务中心,北京市种子管理站. 本标准主要起草人:赵昌平等. 主要农作物品种真实性SSR分子标记检测 普通小麦 范围 本标准规定了普通小麦(Triticum Aestivum L.) 常规品种真实性SSR分子标记的检测原则、检测方案、检测程序和结果报告. 本标准适用于普通小麦常规品种真实性验证和真实性身份鉴定,不适用于实质性衍生品种(EDV)和转基因品种的鉴定. 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件. GB/T 3543.1 农作物种子检验规程 总则 GB/T 3543.2 农作物种子检验规程 扦样 GB/T

6682 分析实验室用水规格和试验方法 术语、定义和缩略语 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准. 品种真实性验证 variety verification 与其对应品种名称的标准样品比较,检测证实供检样品品种名称标注是否名副其实. 品种真实性身份鉴定 variety identification 经SSR分子标记检测并通过审定品种SSR指纹数据比对平台(见3.1.4)筛查比较,确定供检样品的真实品种名称. 标准样品 standard sample 国家指定机构保存的经认定代表审定品种特征特性的实物种子样品. SSR指纹数据比对平台 SSR fingerprint blast platform 采用SSR标记的标准化方法对品种标准样品等位基因进行检测,并运用计算机数据库技术和网络信息技术所构建的审定品种分子数据信息的检索比对载体. 参照样品 reference control sample 用于校准检测样品SSR等位基因已定义扩增产物片段大小的样品. 引物 primer 一条互补结合在模板DNA链上的短单链,能提供3'

-OH末端作为DNA合成的起始点,延伸合成模板DNA的互补链. 组合引物 panel 能够组合在一起电泳的,具有不同颜色或相同颜色而扩增产物片段大小不同的荧光标记的一组引物. 等位基因 allele 在一对同源染色体上同一基因座上的一对基因. 对于SSR检测,等位基因差异以扩增产物片段大小来表示. 对于荧光标记引物,扩增产物片段大小是指一个已定义片段大小的区间范围,本标准将之称为Bin. 缩略语 下列缩略语适用于本标准. bp:base pair,碱基对. CTAB:cetyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵. DNA:deoxyribonucleic acid,脱氧核糖核酸. dNTPs:deoxy-ribonucleoside triphosphates,脱氧核苷三磷酸. PAGE:polyacrylamide gelelectrophoresis,聚丙烯酰胺凝胶电泳. PCR:polymerase chain reaction,聚合酶链式反应. SDS:sodium dodecyl sulfate,十二烷基磺酸钠. SSR:simple sequence repeat,简单序列重复. Taq酶:Taq-DNA polymerase,耐热DNA聚合酶. 总则 小麦的不同品种,其基因组存在着能够世代稳定遗传的简单重复序列 (SSR)的重复次数差异.这种差异可以通过从抽取有代表性的检测样品中提取DNA,用SSR引物进行扩增和电泳,从而通过其扩增产物片段大小不同而加以区分品种. 依据SSR检测原理,采用固定数目的SSR引物,通过与标准样品比较或与SSR指纹数据比对平台比对的方式,对品种真实性进行验证或身份鉴定.真实性验证依据规定数目引物的SSR分子标记差异数目而判定,品种真实性身份鉴定依据SSR分子标记数目没有差异的原则进行筛查、鉴定而确定. 检测方案 总则 对于真实性鉴定和纯度测定,引物、检测平台、样品状况不同,其检测结果准确度、精确度可能有所不同.应依据 适于检测目的 的原则,统筹考虑检测规模和检测能力,择定适宜的引物、检测平台、样品状况,制定相应的检测方案. 在严格控制条件下,合成选择的引物,按照确定的检测平台对检测样品按DNA提取、PCR扩增、电泳、数据分析的程序进行检测. 按规定要求填报检测结果,检验报告应注明检测方案所选择的影响检测结果的关键信息. 检测平台 5.2.1 电泳是检测的关键环节,对于真实性鉴定,可选择采用变性PAGE垂直板电泳、毛细管电泳,但应注意变性PAGE垂直板电泳检测数据与SSR指纹比对平台比对困难,需要利用参照品种确定送检样品的指纹后再进行真实性身份鉴定. 5.2.2 对于检测样品量较大的,可将组织研磨仪、DNA自动提取、自动移液工作站、高通量PCR扩增仪、多引物组合的毛细管电泳进行组合,以提高检测的综合效率. 5.2.3 DNA提取、PCR扩增、电泳的技术条件要求,在适于检测目的和不影响检测质量的前提下,按照检测平台的要求允许对本标准的规定作适宜的局部改进. 引物 5.3.1 检测引物数目越多,结果漏检和误判的概率降低,工作量也随之增加,这需要依据检测目的在可接受结果准确率的前提下进行兼顾.经对我国审定小麦品种进行全面试验后,依据高分辨率、染色体均匀分布等筛选原则,本标准遴选了42对SSR引物作为品种真实性鉴定的检测引物,具体见表1,并据此构建了已知品种的SSR指纹数据比对平台.表1引物分为I、II两组,编号PM01~PM21为I组,,