PDF《·实验研究·》

后者 虽然快速, 但易造成较多的假阳性和假阴性[1] . 因此建立一种快 速、 准确的布鲁氏菌检测方法, 对布病的诊断、 治疗、 预防以及 最终控制布病均具有重要的意义. 本研究根据 BSCP31 基因编 码31KDa 的布鲁氏杆菌表面蛋白的核苷酸序列设计了

1 对PCR 特异引物, 通过对影响 PCR 扩增条件的优化, 建立了布鲁 氏菌复合探针荧光定量 PCR 的检测方法,为快速筛查布鲁氏 菌提供了简易、 可行的方法, 对布病的准确诊断及防控策略的 制定有重要意义.

1 材料与方法 1.1 试剂和菌种 美国 Transgenomic 公司荧光标记试剂套装;

分析纯饱和 氨水 (上海分析试剂厂 ) ;

丙腈, HPLC 级 (美国 Sigma 公司) ;

羊 种布鲁氏菌

25840 (ATCC ) , 牛种布鲁氏菌

2308 (中国兽医药品 监察所) , 阴性特异性参考菌株

20 株 (购置 ATCC 或CMCC ) , 其它

56 株非布鲁氏菌 (浙江省疾病预防与控制中心提供) ;

DNA 测序试剂盒 (Beckman 公司) .pGEM-T 载体试剂盒

4054 ・ ・ 现代生物医学进展 www.shengwuyixue.com Progress in Modern Biomedicine Vol.11 NO.21 NOV.2011 (Promega 公司 ) ;

质粒提取试剂盒 (Promega 公司 ) ;

PCR 产物回 收试剂盒(Promega 公司) ;

10*PCR Buffer(100mmol/L TrisH- Cl,pH8.3, 500mmol/LKCl)自制. 1.2 实验仪器 美国 ABI 公司 PE3900 及Expedite8909 全自动 DNA 合成 仪;

美国 Labconco TRIAD2.5l 冷冻干燥机;

美国 Beckman 公司 DU640 紫外检测仪;

美国 Bio-rad 公司 iCycler IQ 荧光定量 PCR 仪. 1.3 引物 根据GenBank 中公布的布鲁氏菌BSCP31 基因编码31KDa 的基因序列 (参考序列登录号为 GU317364 ) 设计特异 性引物如下: 上游引物的基因序列 BRF1 为: 5'

- CAAGGGCAAGGTG- GAAGATT -3'

;

下游引物的基因序列BRR1 为:5'

-CTGCGACC- GATTTGATGTTT -3'

荧光探针的基因序列 FPBR1 为: 5'

- FAM-ATCGTTTC- CGGGTAAAGCGTCGCCA-P-3'

淬灭探针的基因序列 QPBR1 为: 5'

- CGCTTTACCCG- GAAACGA -DABCYL-3'

1.4 方法 1.4.1 核酸提取方法 取50μl 1*109CFU/mL 的细菌参考品, 置于沸水浴中煮沸

10 分钟, 10000*g 离心

2 分钟, 取2μl 上清 作为 PCR 模板. 1.4.2 PCR 反应体系 反应体系为 25μl: 10mmol/L 的Tris-HCl, pH 为8.0;

50mmol/L 的KCl;

体积百分比 3%甲酰胺;

5 mmol/L MgCL2;

100μmol/L 的dATP、 dCTP、 dGTP、 dTTP;

0.5 mol/L 的 的上游引物, 0.5 mol/L 的下游引物, 1.5U Taq 酶, 100nmol/L 的 荧光探针, 200nmol/L 的淬灭探针;

PCR 反应程序为:预变性 95℃3min、 94℃5s、 扩增的退火温度为 54℃20s 共40 个循环. 1.4.3 PCR 的特异性测定 用上述方法分析

2 株布鲁氏杆菌阳 性特异性参考品 (羊种布鲁氏菌和牛种布鲁氏菌 ) 见表

1、

20 株 阴性特异性参考品和

56 株肠道菌株(浙江省疾病预防控制中 心提供 ) . 表1阳性特异性菌株相关信息 Table

1 Information of specific positive strain 菌株编号 Strain number 浓度Concentration (CFU/mL ) 来源 Source 羊种布鲁氏菌 Brucella melitensis

25840 1106 ATCC* 牛种布鲁氏菌 Brucella abortus

2308 1106 中国兽医药品监察所 China Institute of Veterinary Drugs Control 1.4.4 PCR 的敏感性测定 取不同菌数的细菌参考品 (1*101 、 1*102 、 1*103 、 1*104 、 1*105 、 1*106 CFU/ml ) 各50μl,加入 50μlDNA 提取液, 混匀后加热煮沸

10 分钟后, 转入 40C 放置

10 分钟, 然后离心取上清 2μl 作为模板, 按上述优化后的方法 进行荧光 PCR 检测. 1.4.5 PCR 的重复性测定 将强阳性质控品、 临界阳性质控品和 阴性质控品采用直接水煮法提取核酸, 各取 2μl 用上述方法进 行实时荧光 PCR 检测,批间重复测定