PDF《·实验研究·》

3 次,批内重复测定五 次, 计算批内及批间差异, 评价该方法的精密度. 1.4.6 标准曲线制备 将克隆有目的基因片段的 PMD18-T 质粒 作为标准品 DNA 模板, 质粒标准品的灵敏度及线性分析: 取不 同DNA 载量的质粒参考品 (1*100 、 1*101 、 1*102 、 1*103 、 1*

104 、 1*105 、 1*106 ) 各2μl, 进行荧光定量 PCR 检测. 1.4.7 模拟标本的测定 布鲁氏菌污染的血液模拟标本及阳性 对照样本提取 DNA 作为模板, 按上述荧光定量 PCR 的反应体 系及反应程序在荧光定量 PCR 仪上进行扩增,反应体系及扩 增条件与做标准曲线时一致.

2 结果 2.1 检测结果的特异性 用本法分析了

2 株布鲁氏杆菌阳性特异性参考品 (羊种布 鲁氏菌和牛种布鲁氏菌) 、

20 株阴性特异性参考品和

56 株肠 道菌株.20 株阴性特异性参考品和

56 株肠道菌株检测结果均 未阴性,

2 株布鲁氏杆菌阳性特异性参考品检测结果为阳性, 结果见表 2.从检测结果可知,该方法检测结果的特异性为 100%. 表2阳性特异性菌株检测结果 Table

2 Test result of specific positive strain 菌株名称 Strain name 检测结果 Test result 菌株名称 Strain name 检测结果 Test result 羊种布鲁氏菌 Brucella melitensis

25840 25.4 牛种布鲁氏菌 Brucella abortus

2308 19.6 2.2 检测结果的敏感性 检测结果从表

3 可知, 最低可检测至 1*102 CFU/ml 细菌. 2.3 检测结果的重复性 检测结果从表

4 可知, 强阳性质控品、 临界质控品和阴性 质控品不同时间测定三次及同一时间五次重复实验, 批内和批 间检测结果的 CV 值均小于 5%. 2.4 标准曲线 从表

5 和图

1 可知, 将下述数据进行回归分析, 得到 PCR 回归方程为: Y=-0.3572X+13.817, 相关系数为 0.9928.实验结 果表明, 在1*101 -1*106 拷贝范围之间, 样本拷贝数与其相应

4055 ・ ・ 现代生物医学进展 www.shengwuyixue.com Progress in Modern Biomedicine Vol.11 NO.21 NOV.2011 的CT 值具有良好的相关性, 因此, 本方法可对 1*101 -1*106 拷贝范围内的模板进行定量,本方法最低可检出

10 个拷贝的 质粒 DNA 分子. 表3检测细菌的灵敏度 Table

3 The sensitivity of the method on bacteria detection 样本浓度 Sample concentration (CFU/ml ) Ct 值Cut off value 1*106 25.473 1*105 29.429 1*104 31.630 1*103 34.530 1*102 38.279 1*101 0.000 表4检测质控品的重复性 Table

4 The repeatability of the method on quality control materials detection 样本 Ct 值1Cutofft value

1 Ct 值2Cutoff value

2 Ct 值3Cut off value

3 Ct 值4Cutoff value

4 Ct 值5Cut offt value

5 Ct 值平均值 Average cut off value SD 批内 Cv% Intra- assay Cv% 批间 Cv% inter- assay Cv% 强阳性质控 品Strong positive control 21.9 21.1 21.9 21.4 21.2 21.5 0.38 1.8 1.7 21.8 21.3 22.0 21.8 21.1 21.6 0.38 1.8 21.5 21.6 22.1 22.2 21.7 21.8 0.31 1.4 临界阳性质 控品 Critical Positive control 33.1 32.9 33.3 33.5 33.9 33.3 0.38 1.1 1.3 33.9 33.4 33.0 33.2 332.4 33.2 0.55 1.6 33.8 33.0 33.7 33.5 33.1 32.4 0.36 1.1 阴性质控品 Negative control

0 0

0 0

0 0

0 0

0 表5检测质粒 DNA 的灵敏度分析 Table

5 The sensitivity of the method on plasmid DNA detection 样本拷贝数 Sample copy quantity Ct 值Cut off value 1*106 21.482 1*105 24.781 1*104 27.698 1*103 30.838 1*102 33.250 1*101 35.227 1*100 0.000 图1荧光定量 PCR 标准曲线 Fig

1 Calibration curve of fluorescent quantitative PCR 2.5 模拟标本检测 从表