PDF《·实验研究·》

6 的检测结果可知, 在模拟污染的血液样品中, 最低 可检出 1*103 CFU/ml 细菌.

3 讨论 目前诊断布病主要采用血清学和细菌学方法. 血清学方法 种类繁多, 但总的来说还没有任何一种方法在特异性、 敏感性 及可操作性等方面均令人满意,细菌培养虽可直接查到病原 体, 但由于布鲁氏菌分离培养条件要求苛刻, 阳性率很低, 且分 离过程中, 存在操作人员面临被布鲁氏菌感染的危险及病菌从 实验室扩散的风险[2] . 近年来, 伴随着分子生物学技术的飞速发 展, 快速特异、 灵敏度高、 操作简便的聚合酶链反应技术已被引 入到细菌性传染病的流行病学调查及诊断中, 并初步显示了其 应用前景[3-5] .国内外学者在利用 PCR 技术检测布鲁氏菌病方 面做了较多的研究工作[6-9] , 其中 Bailey GG 等按牛种布鲁氏菌

4056 ・ ・ 现代生物医学进展 www.shengwuyixue.com Progress in Modern Biomedicine Vol.11 NO.21 NOV.2011 31KDa 外膜蛋白基因的核苷酸序列设计了

5 个引物 B1~B5, 将引物按不同组合做扩增试验, 结果显示 B4 和B5 配对最好[10] . Ohtsuki R 等根据流产布鲁氏菌 BCSP31 株的基因序列设计两 组用于

6 个种布鲁氏菌鉴别的环介导等温扩增(LAMP)的特异 性引物,通过对

6 个种

22 株布鲁氏菌和

18 个种

28 株非布鲁 氏菌的检测表明, 对布鲁氏菌的检测具有特异性(35min, 63℃) 和敏感性(10fg 基因组 DNA)[11] . 李坚等根据布鲁氏菌编码

312 kDa 布鲁氏菌蛋白的基因(BSCP31)和IS711 插入序列及相邻 单染色体 DNA 种的不同, 设计引物, 建立 AMOS-PCR 方法, 用于诊断布鲁氏菌病,并鉴定种 [12] .用布鲁氏菌蛋白的基因 (BSCP31)为引物可以扩增出牛、 羊、 猪型布鲁氏菌, 用IS711 插 入序列及相邻单染色体设计的弓 l 物可以区别不同型别的布 鲁氏菌, 最低可检测到

1 Pg 的布鲁氏菌 DNA. 实时荧光定量 PCR 技术解决了传统 PCR 技术的不足, 已 经成为细菌、 病毒等微生物快速定量检测的首选技术. 目前, 基于FRET 的荧光定量 PCR 技术主要有4种,TaqMan、 Am- plisensor、 Molecular beacon 及Light-Cycler 荧光定量 PCR 技术, 上述实时 PCR 技术均存在一些局限性, 如淬灭不彻底、 合 成和标记复杂、 非特异扩增不易区分等, 但用复合探针实时荧 光定量 PCR 技术, 可以克服上述不足[13-15] .本研究是针对布鲁 氏杆菌 BSCP31 基因的标识序列设计一组特异引物, 用本法分 析了

2 株布鲁氏杆菌阳性特异性参考品 (羊种布鲁氏菌和牛种 布鲁氏菌 ) 和20 株阴性特异性参考品及浙江省疾病预防与控 制中心提供的

56 株其它肠道致病菌. 从实验检测结果可知, 检 测结果全部阴性菌株均阴性, 而阳性对照及阳性菌株结果为阳 性.结果表明, 本检测方法的特异性为 100%, 具有很好的检测 特异性. 通过灵敏度试验本方法可检出

10 个拷贝的质粒 DNA 分子, 可对 1*101 -1*106 拷贝范围内的模板进行定量, 最低可 检测至 1*102 CFU/ml 细菌.通过重复性试验该方法的精密度 很好, 阳性质控品和阴性质控品不同时间测定三次及同一时间 五次重复实验结果 CV 值均小于 5%. 本研究建立了复合探针实时荧光定量 PCR 检测布鲁氏杆 菌的方法, 该方法灵敏度高、 特异性强和重复性好, 可对布鲁氏 病原菌进行快速检测、 准确辨别和早期诊断, 对布病的筛选和 确诊具有重要意义. 参考文献(References) [1] 姜凤华,于刚.布鲁氏菌 PCR 快速检测方法的建立[J].现代畜牧兽 医,2008(2):4-5 Jiang Fen-hua, Yu Gang. The study on the method of the ........