PDF《ICS 11.020》

ICS 11.

020 C

61 WS 中华人民共和国卫生行业标准WS/T 633―2018 巴贝虫检测 虫种核酸鉴定法 Detection of Babesia spp.――Identification of species by nucleic acid method

2018 -

09 -

26 发布

2019 -

04 -

01 实施 中华人民共和国国家卫生健康委员会 发布WS/T 633―2018 I 前??言 本标准按照 GB/T 1.1―2009 给出的规则起草. 本标准由国家卫生标准委员会寄生虫病标准专业委员会提出. 本标准起草单位:中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所、复旦大学、第二军医大学. 本标准起草人:刘琴、周晓农、张仪、胡薇、陈家旭、朱淮民. WS/T 633―2018

1 巴贝虫检测 虫种核酸鉴定法

1 范围 本标准规定了检测巴贝虫的虫种核酸鉴定法. 本标准适用于各级疾病预防控制机构和医疗机构对巴贝虫的检测.

2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的. 凡是注日期的引用文件, 仅所注日期的版本适用于本文 件.凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件. WS/T

564 巴贝虫病诊断

3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件. 3.1 巴贝虫 Babesia spp. 一类寄生于人和脊椎动物红细胞内的原虫,可引起巴贝虫病(babesiosis).感染人体的巴贝虫种 类主要有田鼠巴贝虫 (Babesia microti)、分歧巴贝虫(B. divergens)、邓肯巴贝虫(B. duncani)和猎户 巴贝虫(B. venatorum)等(参见附录A).

4 仪器和器材 4.1 高速离心机 最大相对离心力为

12 000*g. 4.2 涡旋仪 无级调速范围为

200 r/min~3

000 r/min. 4.3 PCR 扩增仪 温度范围为 4℃~99 ℃,温度精确为 0.1 ℃,热盖为

105 ℃. 4.4 微波炉 4.5 电泳仪 电压为

5 V~5

000 V,电流为

1 mA~500 mA. WS/T 633―2018

2 4.6 凝胶成像系统 镜头分辨率(H * V)为1360 *

1 024,光源为透射 UV.

5 试剂和材料 5.1 分子生物学试剂 Taq 酶、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)、分子质量指示物及核酸提取试剂盒选用商品化产品. 5.2 化学试剂 Tris-乙酸电泳缓冲液(TAE)、琼脂糖凝胶、6*加样缓冲液(参见附录B). 5.3 引物 扩增巴贝虫 18S 核糖体RNA (18S rRNA)基因和转录间隔区(ITS)基因的特异性引物(见附录 C). 5.4 参照材料 阳性对照为田鼠巴贝虫 peabody mjr 株基因组 DNA. 空白对照为去离子灭菌水. 阴性对照为健康人全血基因组DNA.

6 检测步骤 6.1 样品 样品为临床诊断或疑似巴贝虫病病例抗凝血样品. 6.2 虫种核酸鉴定 6.2.1 核酸提取 基因组DNA提取采用商品化全血DNA提取试剂盒(参见附录 B). 6.2.2 18S rRNA 基因扩增 见附录 C. 6.2.3 ITS 基因扩增 见附录 C. 6.2.4 结果判定 6.2.4.1 电泳分析 6.2.4.1.1 电泳 WS/T 633―2018

3 取第二轮PCR产物

5 ?L与1μL 6*加样缓冲液混合, 加样于含溴化乙锭替代物的 1.0%琼脂糖凝胶 中,在1*TAE 缓冲液中,5 V/cm 电泳约

40 min,当溴酚蓝到达底部时停止电泳,用凝胶成像系统或 紫外分析仪分析. 6.2.4.1.2 PCR 结果判断 6.2.4.1.2.1 PCR 扩增巴贝虫 18S rRNA 基因,出现大小为

400 bp 左右特异性的扩增片段,空白对 照和阴性对照未出现条带, PCR 结果阳性. PCR 扩增巴贝虫 18S rRNA 基因, 未出现大小为

400 bp 左 右特异性的扩增片段,空白对照和阴性对照未出现条带,PCR 结果阴性. 6.2.4.1.2.2 PCR 扩增巴贝虫 ITS 基因,出现大小在

700 bp~2

100 bp 的特异性的扩增片段,空白对 照和阴性对照未出现条带,PCR 结果阳性.PCR 扩增巴贝虫 ITS 基因,未出现特异性的扩增片段,空 白对照和阴性对照未出现条带,PCR 结果阴性. 6.2.4.2 测序分析 阳性 PCR 扩增产物进行双向测序,将序列进行 BLAST 比对分析(见附录 C). 6.2.4.3 虫种鉴定 根据PCR扩增产物电泳结果与测序结果分析,综合判定虫种种类(见附录C). WS/T 633―2018