PDF《ICS 11.020》

5 5′-AATTACCCAATCCTGACACAGG-3′

400 bp 左右 [3] Bab

8 5′-TTTCGCAGTAGTTCGTCTTTAACA-3′ 18S rRNA 内侧引物 Bab

6 5′-GACACAGGGAGGTAGTGACAAGA-3′ Bab

7 5′-CCCAACTGCTCCTATTAACCATTAC-3′ ITS 外侧引物 ITS-F3 5′-GGTGGTGCATGGCCG-3′

700 bp~2

100 bp [4] ITS-R3 5′-T(A/T)GCGCTTCAATCCC-3′ ITS 内侧引物 ITS-F4 5′-GAGAAGTCGTAACAAGGTTTCCG-3′ ITS-R4 5′-GCTTCACTCGCCGTTACTAGG-3′ a 18S rRNA 基因引物序列和 PCR 反应引自 WS/T

564 . b 不同虫种片段大小不同. C.2 引物配制 引物用去离子灭菌水配制成100 μmol/L储备液.然后取出一部分,加入相应体积的去离子灭菌水稀 释成20 μmol/L的工作液备用. C.3 18S rRNA PCR反应体系及反应条件 C.3.1 18S rRNA PCR第一轮反应 C.3.1.1 以引物Bab 5和Bab 8进行第一轮扩增,反应体系为

50 μL. Taq 酶(5 U/μL) 0.25 μL 10*PCR缓冲液(含15 mmol/L Mg2+ )

5 μL

25 mmol/L dNTPs

4 μL

20 μmol/L Bab

5 1.5 μL WS/T 633―2018

7 20μmol /L Bab

8 1.5 μL 基因组DNA模板(约70 ng)

2 μL 去离子灭菌水 35.75 μL 总计

50 μL PCR 反应需设立阳性、阴性和空白对照. C.3.1.2 PCR 条件

95 ℃

5 min;

95 ℃

45 s,55 ℃

45 s,72 ℃

1 min,共35个循环;

72 ℃

7 min;

4 ℃ ∞. C.3.2 18S rRNA PCR第二轮反应 C.3.2.1 取第一轮PCR产物2 μL为模板,以引物Bab 6和Bab 7进行第二轮扩增,反应体系为

50 μL. Taq 酶(5 U/μL) 0.25 μL 10*PCR 缓冲液(含15 mmol/L Mg2+ )

5 μL

25 mmol/L dNTPs

4 μL

20 μmol /L Bab6 1.5 μL

20 μmol /L Bab7 1.5 μL 第一轮PCR产物

2 μL 去离子灭菌水 35.75 μL 总计

50 μL C.3.2.2 PCR 条件

95 ℃

5 min;

94 ℃

45 s,55 ℃

45 s,72℃

1 min,共35个循环;

72 ℃

7 min;

4 ℃ ∞. C.4 ITS PCR反应体系及反应条件 C.4.1 ITS PCR第一轮反应 C.4.1.1 以引物ITS-F3和ITS-R3进行第一轮扩增,反应体系为

50 μL. Taq 酶(5 U/μL) 0.25 μL 10*PCR 缓冲液(含15 mmol/L Mg2+ )

5 μL

25 mmol/L dNTPs

4 μL

20 μmol /L ITS-F3 1.5 μL

20 μmol/L ITS-R3 1.5 μL 基因组DNA模板(约70 ng)

2 μL 去离子灭菌水 35.75 μL 总计

50 μL PCR 反应需设立阳性、阴性和空白对照. C.4.1.2 PCR条件

95 ℃

5 min;

94 ℃

30 s,50 ℃

30 s,72 ℃

2 min,共35个循环;

72 ℃

10 min;

4 ℃ ∞. C.4.2 ITS PCR第二轮反应 C.4.2.1 取第一轮PCR产物

2 μL为模板,以引物ITS-F4和ITS-R4进行第二轮扩增,反应体系为

50 μL. WS/T 633―2018

8 Taq 酶(5 U/μL) 0.25 μL 10*PCR缓冲液(含15 mmol/L Mg2+ )

5 μL

25 mmol/L dNTPs

4 μL

20 μmol /L ITS-F4 1.5 μL

20 μmol /L ITS-R4 1.5 μL 第一轮PCR产物

2 μL 去离子灭菌水 35.75 μL 总计

50 μL C.4.2.2 PCR 条件

95 ℃

5 min;

94 ℃

30 s,60 ℃

30 s,72 ℃

2 min,共35个循环;

72 ℃

10 min;

4 ℃ ∞. 注:PCR实验符合WS/T 230的规定. C.5 测序结果分析 序列同源性分析利用Blastn (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&

PAGE_TYPE =BlastSearch&

LINK_LOC=blasthome),根据序列的相似度,判断样本所扩增序列的巴贝虫种类: a)18S rRNA 基因序列与GenBank中巴贝虫18S rRNA序列相似度96%以上,或是 ITS 基因序列与 GenBank中ITS 序列相似度95%以上,判定为巴贝虫;

b) 18S rRNA 基因序列与田鼠巴贝虫18S rRNA序列相似度99%以上,或是 ITS 基因序列与田鼠 巴贝虫ITS 序列相似度 98%以上,判定为田鼠巴贝虫;

c)18S rRNA 基因序列与分歧巴贝虫18S rRNA序列相似度99%以上,或是 ITS 基因序列与分歧巴 贝虫ITS 序列相似度98%以上,判定为分歧巴贝虫;