DOC《关于细胞复苏》

另一种情况是非晶体即玻璃化,液体中的分子呈无序状态,保持未凝固前的状态. 不同的冷冻速度既然能使细胞内发生不同的生理变化,也可以对细胞产生不同的损伤.当冷冻速度过慢时,细胞脱水严重,细胞体积严重收缩,超过一定程度时即失去活性.同时冷冻速度过慢,还会引起细胞外溶液部分结冰,从而使细胞外未结冰的溶液中溶质浓度增高,产生溶质损伤.当冷冻速度过快时,细胞内水分来不及外渗,会形成较到冰晶,造成细胞膜及细胞器的破坏,产生细胞内冰晶损伤.超快速玻璃化冷冻对细胞存活来说是最为理想的冷冻方法.细胞内外呈玻璃化凝固,无冰晶形成或形成很小的冰晶,对细胞膜和细胞器不致造成损伤,细胞也不会在高浓度的溶质中长时间暴露而受损. 不同细胞的最适冷冻速率不同.小鼠骨髓干细胞、酵母、人红细胞的最适冷冻速率分别为1. 60C/min、70C/min和2000C/min.细胞与细胞之间的最适冷冻速率可在1.60C~3000C/min,故对一种细胞进行冷冻保存之前,首先需要测定其最适冷冻速率,以保证获得最高的冷冻存活率. 冷冻保存温度 冷冻保存温度是指能长期保存细胞的超低温度,在此温度下,细胞生化反应极其缓慢甚至停止,但经过长期保存,在复苏后仍能保持正常的结构和功能. 不同的细胞和生物体以及使用不同的冷冻保存方法要取得同样的冷冻保存效果,冷冻保存温度可以不同.但从实际和效益的观点出发,液氮温度(-1960C)是 目前最佳的冷冻保存温度.在-1960C时,细胞的生命活动几乎完全停止,但复苏后细胞的结构和功能完好.如果冷冻过程得当,一般生物样品在-1960C下均可保存十年以上.应用-700C~-800C保存细胞,短期内对细胞的活性无明显影响,但随着冻存时间延长,细胞存活率明显降低.在冰点到-400C范围内保存细胞的效果不佳. 复苏速率 冷冻保护体外培养物,除了必须有最佳的冷冻速率、合适的冷冻保护剂和冻存温度外,在复苏时也必须有最佳的复温速率,这样才能保证最后获得最佳冷冻保存效果. 复温速率是指在细胞复苏时温度升高的速度.复温速率不当也会降低冻存细胞存活率.一般来说,复温速度越快越好.常规的做法是,在370C水浴中,于1-2分钟内完成复苏.复温速度过慢,细胞内往往重新形成较大冰晶而造成细胞损伤.复温时造成的细胞损伤非常快,往往在极短的时间内发生. 冷冻保护剂 冷冻保护剂是指可以保护细胞免受冷冻损伤的物质.冷冻保护剂常常配制成一定的溶液.一般来讲,只有红细胞、大多数微生物和极少数有核的哺乳动物细胞悬浮在不加冷冻保护剂的水或简单的盐溶液中,并以最适的冷冻速率冷冻,可以获得活的冻存物.但对于大多数有核哺乳动物细胞来说,在不加冷冻保护剂的情况下,无最适冷冻速率可言,也不能获得活的冷冻物.例如将小鼠骨髓细胞悬浮在不加冷冻保护剂的平衡盐溶液中,并以0.3~6000C/min的冷冻速率降温冷冻,98%以上的细胞会死亡;

而加入甘油冷冻保护剂进行冷冻保存时,98%以上的细胞都可存活. 冷冻保护剂可分为渗透性和非渗透性两类.渗透性冷冻保护剂可以渗透到细胞内,一般是一些小分子物质,主要包括甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等.其保护机制是在细胞冷冻悬液完全凝固之前,渗透到细胞内,在细胞内外产生一定的摩尔浓度,降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度,从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤,同时,细胞内水分也不会过分外渗,避免了细胞过分脱水皱缩.甘油和DMSO并不防止细胞内结冰,在使用该类冷冻保护剂时,需要一定的时间进行预冷,让甘油或DMSO等成分渗透到细胞内,在细胞内外达到平衡以起到充分的保护作用.目前DMSO的应用比甘油更为广泛,但要注意的是,DMSO在常温下对细胞的毒性作用较大,而在40C时,其毒性作用大大减弱,且仍能以较快的速度渗透到细胞内.所以,冻存时DMSO平衡多在40C下进行,一般需要40~60分钟. 非渗透性冷冻保护剂不能渗透到细胞内,一般是些大分子物质,主要包括聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白以及羟乙基淀粉等.其保护机制的假说很多,其中有一种可能是,聚乙烯吡咯烷酮等大分子物质可以优先同溶液中水分子结合,降低溶液中自由水的含量,使冰点降低,减少冰晶的形成;