DOC《关于细胞复苏》

(3)设备:液氮储存罐;

(4)待冻存细胞:人类外周血单核细胞. 冻存过程 (1) 用常规方法分离全血中单核细胞;

(2) 在冰浴中预冷冷冻保护液;

(3) 将装有单核细胞的离心管放置入盛有冰水的烧杯内(冰浴);

(4) 沿离心管壁缓慢滴加预冷的冷冻保护液.滴加过程为:前3min以0.3ml/min速度滴加,后5min以0.6ml/min速度滴加,余下的冻存液以0.75ml/min速度滴加.2*107个细胞要滴加15ml冻存液.滴加的时间在15min左右.最终细胞密度要在1*106~1.5*106个细胞/ml,边滴加边轻轻晃动离心管;

(5) 轻轻吹吸混匀细胞冷冻悬液;

(6) 将细胞冷冻悬液分装于冻存管中.12cm长的冻存管装0.8ml细胞冷冻悬液;

(7) 将冻存管两端以火焰封口;

(8) 最后将冻存管直接投入液氮中保存.降温速度约为6000C/min. 冻存结果 如此冻存的细胞,其存活率可达90%以上. 讨论 玻璃化冻存法对细胞活性的保存具有较好的效果,不需要复杂的仪器设备,具有液氮储存设备即可使用.目前,该方法已在胚胎冷冻方面得到广泛应用,但很少应用于一般细胞的冻存.这可能与需要配制较复杂的冻存液以及冷冻前和复苏后较烦琐的操作有关. 因为玻璃化冷冻保护液中的冷冻保护剂的浓度较高,室温下对细胞具有毒性(但在40C时毒性大为减弱).所以,冷冻保护液的滴加全过程必须在40C冰浴中进行.另外,滴加速度要缓慢,如果滴加速度过快,则在细胞外产生很高的渗透压,造成细胞膜的损伤,导致细胞死亡,故要缓慢滴加,让冷冻保护剂有足够的时间缓慢渗透到细胞内,达到细胞内外的平衡. 冻存细胞的复苏 非玻璃化冻存的复苏方法 主要材料 (1) 仪器设备:恒温水浴箱、高速离心机;

(2) 培养用液:完全培养液. 复苏过程 (1) 调配370C~400C的温水,或将恒温水浴箱的温度调节至370C~400C;

(2) 从液氮中取出冻存管,立即投入370C~400C 温水中迅速晃动,直至冻存液完全溶解;

(3) 将细胞冻存悬液转移到离心管内,加入约5ml培养液,轻轻吹打混匀;

(4) 将细胞悬液经800~1000r/min离心5min,弃上清夜;

(5) 向细胞沉淀内加入完全培养液,轻轻吹打混匀,将细胞悬液转移到培养瓶内,补足培养液进行培养. 结果 复苏后的细胞应该保持其冻存时的活力,活细胞数达90%以上. 讨论 细胞冻存悬液一旦融解后,要尽快离心除去冷冻保护液,防止冷冻保护剂对细胞产生毒性.实验人员在复苏细胞过程中,同样应具有自我保护意识,避免被液氮冻伤. 玻璃化冻存的复苏方法 以下以人的单核细胞为例说明其过程(Takhashi et al. 1986). 主要材料 (1)设备:高速离心机;

(2)培养用液:添加20%胎牛血清的Hanks平衡盐溶液、培养液. 操作过程 (1) 将冻存管从液氮中取出,立即投入冰浴中5min.复温速率约5600C/min.一次可以进行多个冻存管的复苏;

(2) 将冻存管两端剪断,可以将5ml细胞冻存悬液转移到50ml离心管中;

(3) 沿离心管壁缓慢加入已在冰浴中预冷的含20%胎牛血清的Hanks平衡盐溶液.前10min以0.2........