PDF《中国实验动物学会》

四、编制原则 本标准的编制主要遵循以下原则: 一是科学性原则. 在尊重科学、 亲身实践、 调查研究的基础上, 制定本标准. 二是可操作性原则. 本标准无论是从样品采集, 处理,检测.具有可操作性和实用性.三是协调性原则.以切实提高我国实验动 物病原微生物检测技术水平为核心,符合我国现行有关法律、法规和相关的标准 要求.

五、 标准主要技术内容说明,确定标准主要内容(如技术指标、参数、公式、 性能要求、试验方法、检验规则等)的论据(包括试验、统计数据) 本标准由范围;

规范性引用文件;

缩略语;

检测方法原理;

主要设备和材料;

试剂;

检测方法、结果判定、附录共九章构成.现将《实验动物肺支原体普通 PCR 和实时荧光 PCR 检测方法》征求意见稿主要技术内容确定说明如下:

1 本标准范围的确定 本标准适用于实验动物及其产品、分离培养物、细胞培养物、实验动物环境 和动物源性生物制品中肺支原体的检测.

2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注明日期的引用文件,仅注 日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的 修改单)适用于本文件. GB

19489 实验室 生物安全通用要求

3、缩略语 下列缩略语适用于本标准 Ct 值 荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数(cycle threshold) DNA 脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid) PBS 磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline) PCR 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction) 实时荧光 PCR 实时荧光聚合酶链式反应(real-time PCR)

4 检测方法原理 用合适的方法提取样本中的肺支原体DNA,针对支原体核酸16sRNA基因设 计特异的引物序列,通过PCR对模板DNA进行扩增,根据PCR检测结果判定该样 品中是否含有肺支原体核酸成分. 实时荧光 PCR 方法是在常规 PCR 的基础上, 加入了一条特异性的荧光探针, 探针两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团.探针完整时,报告基 团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;

PCR 扩增时,Taq 酶的 5'

→3'

外切酶活性将 探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,淬灭作用消失,荧光信号 产生并被检测仪器接受,随着 PCR 反应的循环进行,PCR 产物与荧光信号的增 长呈对应关系.因此,可以通过检测荧光信号对核酸模板进行检测.

5 主要设备和材料 规定了检测方法所需要的设备和材料.

6 试剂 6.1 灭菌 PBS.配制方法在标准附录中给出. 6.2 DNA 抽提试剂: 基因组 DNA 提取试剂盒 DNeasy Blood &

Tissue Kit, (Qiagen 公司,Cat.No.69504)或其他等效产品. DNA 抽提试剂给出了具体的信息,目 的是为了方便标准的使用者, 并不表示对该产品的认可.如果其他等效产品具有 相同的效果,则可以使用这些等效产品. 6.3 无水乙醇. 6.4 PCR 试剂: Premix Taq TM (Version 2.0 plus dye) (Takara 公司, Cat.No.RR901A) 或其他等效产品.PCR 试剂均给出了具体的信息,目的是为了方便标准的使用 者,并不表示对该产品的认可.如果其他等效产品具有相同的效果,则可以使用 这些等效产品. 6.5 实时荧光PCR 试剂:Premix Ex Taq? (Probe qPCR) , ( Takara 公司,Cat.No.DRR390S)或其他等效产品.实时荧光 PCR 试剂均给出了具体的信息, 目的是为了方便标准的使用者, 并不表示对该产品的认可.如果其他等效产品具 有相同的效果,则可以使用这些等效产品. 6.6 DNA 相对分子质量标准:100bp~2 000bp . 6.7 50*TAE 电泳缓冲液,配制方法在标准附录中给出. 6.8 溴化乙锭:10mg/mL,配制方法在标准附录中给出.或其他等效产品. 6.9 1.5%琼脂糖凝胶,配制方法在标准附录中给出. 6.10 引物和探针:根据表