PDF《中国实验动物学会》

1 和表

2 的序列合成引物和探针,引物和探针加无灭 菌去离子水配制成 10μmol/L 储备液,-20℃保存. 普通 PCR 引物设计根据 GenBank 中收录的肺支原体 16sRNA 基因序列 (Genebank 登录号 NC001510)为模板,利用 Primer Primer5..0 软件设计一套针 对16sRNA 基因的 PCR 引物,并使用 Genebank 的Blast 软件与数据库其他微生 物序列进行比较,保证引物和探针序列的通用性和特异性. 表1:普通 PCR 检测引物 引物名称 引物序列(5'

→3'

) 检测基因 产物大小 (bp) Forward primer AGCGTTTGCTTCACTTTGAA 16sRNA

266 Reverse primer GGGCATTTCCTCCCTAAGCT 引物和探针设计同样根据肺支原体 16sRNA 基因序列(Genebank 登录号 NC001510)为模板,利用 Primer Express3.0 软件(Applied Biosystems 公司)设 计一套荧光定量 PCR 引物和探针(表2) . 表2:实时荧光 PCR 扩增引物和探针 引物和探针名称 引物和探针序列(5'

→3'

) 产物大小(bp) Forward primer GGAAATGCCCTAAGTATGACGG

94 Reverse primer CGGATAACGCTTGCACCCTA Probe FAM-CCTTGTCAGAAAGCACCGGCTAACTATGTG -BHQ-1 注2:探针也可选用具有与 FAM 和BHQ-1 荧光基团相同检测效果的其他合适的荧光报告基团和荧光淬灭 基团组合. 7.3 操作方法 7.3.1 采样及样本的处理 标准规定了动物脏器组织,细菌分离培养物,细胞培养物,实验动物饲料、 垫料和饮水,实验动物设施设备样本的采集及处理方法. 7.3.2 样本 DNA 提取 规定了样本 DNA 的提取方法.对两种不同核酸提取方法进行比较,采用市 售的 组织基因组 DNA 提取试剂盒 TIANamp Tissue DNA Kit(天根公司) 和 DNeasy Blood &

Tissue Kit(Qiagen 公司) 对20 份肺组织物样本,按各自说明 书进行核酸抽提.采用 NanoDrop2000c 仪器对抽提的核酸进行浓度和纯度 (OD260/OD280)检测.将两种方法提取的 DNA 模板,采用肺支原体 PCR 分 别进行检测,统计检测结果,比较两种提取方法用于 PCR 扩增的检出率.结果 两种方法的提取效果相当,OD260/OD280 均在 1.8-2.0 之间,满足 DNA 模板的 纯度要求(表3) .将上述提取的 DNA 模板,进行肺支原体检测,结果两种提取 方法用于 PCR 扩增的检出率一致(表4).因此,两种核酸提取方法均适合用 于该检测方法. 表3提取 DNA 模板的浓度、纯度比较结果 样本编号 TIANamp Tissue DNA Kit DNeasy Blood &

Tissue Kit OD260/OD280 浓度 ng/μl OD260/OD280 浓度 ng/μl

1 1.87 89.2 1.95 90.1

2 1.91 92.6 1.99 93.3

3 1.85 74.5 1.97 75.0

4 1.96 102.3 1.98 105.5

5 1.93 86.5 1.96 86.7

6 1.88 79.1 1.93 80.6

7 1.87 88.6 1.96 89.5

8 1.95 96.8 1.99 96.3

9 1.93 89.9 1.97 90.6

10 1.82 77.3 1.87 77.8

11 1.89 73.6 1.96 74.1

12 1.84 85.2 1.88 85.6

13 1.96 93.6 1.93 94.2

14 1.86 65.3 1.92 65.7

15 1.87 88.6 1.89 89.7

16 1.80 91.5 1.86 91.9

17 1.90 92.3 1.93 95.4

18 1.86 84.8 1.95 85.4

19 1.89 87.5 1.92 89.4

20 1.81 66.4 1.85 66.3 表4检出率比较结果 试剂 检出率 参考值 TIANamp Tissue Kit 18/20 18/20 DNeasy Blood &

Tissue Kit 18/20 7.3.3 PCR 7.3.3.1 PCR 反应体系 PCR 反应体系见表 5.反应液的配制在冰上操作,每次反应同时设计阳性 对照、 阴性对照和空白对照,其中阳性对照以含有肺支原体的组织或培养物提取 的DNA 作为阳性对照模板,其中阴性对照以不含有肺支原体 DNA 样本(可以 是正常动物组织或正常培养物) 作为阴性对照模板,空白对照即为不加模版对照 (No Template Control,NTC) ,即在反应中用水来代替模板. 表5每个样品反应体系配制表 反应组份 用量/μL 终浓度 2*Premix Taq Mix (plus dye)