PDF《中国实验动物学会》

25 1* Forward Primer(10μM)

2 400nM Reverse Primer(10μM)

2 400nM DNA 模版

10 灭菌去离子水

11 总体积

50 7.3.3.2 PCR 反应参数 PCR 反应参数见表 6: 表6: PCR 反应参数 步骤 温度 时间 循环数 预变性 95℃ 5min

1 变性 94℃ 1min

35 退火 55℃ 1min 延伸 72℃ 2min 延伸 72℃ 10min

1 7.3.4 PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳检测和拍照 将适量 50*TAE 稀释成 1*TAE 溶液,配制含核酸染料溴化乙锭的 1.5%琼脂 糖凝胶.PCR 反应结束后,取10μL PCR 产物在 1.5%琼脂糖凝胶进行电泳检测, 以DNA 分子量作参照.电压大小根据电泳槽长度来确定,一般 控制在 3V/cm~5V/cm,当上样染料移动到凝胶边缘时关闭电源.电泳完成后在凝胶成像 系统拍照记录电泳结果. 7.4 结果判定 7.4.1 质控标准 在阴性、 阳性对照成立的条件下,即阳性对照的扩增产物经电泳检测可见到 266bp 扩增条带,阴性对照的扩增产物无任何条带,可进行结果判定. 7.4.2 结果判定 7.4.2.1 样本经琼脂糖凝胶电泳,在凝胶成像仪上观察到 266bp 扩增条带,判为 肺支原体核酸阳性;

7.4.2.2 样本经琼脂糖凝胶电泳,在凝胶成像仪上未观察到 266bp 扩增条带,判 为肺支原体核酸阴性. 7.4.2.3 必要时,可取待检样本扩增出 的阳性 PCR 产物进行核酸序列测定,序 列结果与已公开发表的肺支原体特异性片段序列进行比对,序列同源性在 90% 以上,可确诊待检样本肺支原体核酸阳性,否则判定肺支原体核酸阴性. 7.5 实时荧光 PCR 7.5.1 采样及样本的处理 采样及样本的处理同 4.3.1. 7.5.2 样本 DNA 提取 样本 DNA 提取同 4.3.2. 7.5.3 实时荧光 PCR 规定了实时荧光 PCR 反应体系和反应参数.反应体系和反应参数的确定依 据以下优化试验. 7.5.3.1 方法优化 实时荧光 PCR 反应选用的试剂盒为 Premix Ex Taq? (Probe qPCR), (Takara 公司,Cat.No.DRR390S) ,扩增和检测在全自动荧光定量仪 Applied Biosystems

7500 Real-Time PCR Systems 上进行. 7.5.3.1.1 扩增程序的确定 根据引物、 探针的具体特性,仪器上的反应程序在退火延伸条件选择上试验 了3种温度和

3 种时间: 95℃ 30sec,95℃ 5sec → (58/60/62)℃ (34/45/60)sec,40 次循环, 在退火延伸阶段采集荧光信号.各种试剂的加样量分别为每个反应管中 含2*Premix Ex Taq 25μl, Forward Primer(10μM) 1μl、 Reverse Primer(10μM) 1μl........