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http://www.longmed.com 体内可见光成像技术用于干细胞研究 王俊

1 , 张怡

2 , 赵春林

1 1 龙脉得生物技术有限公司,

2 中国协和医学院, 北京清华大学, 学研大厦 A304. 邮编:100084 导言 干细胞在肿瘤治疗、组织工程和细胞治疗等方面拥有巨大的潜力.如果在活体动物体 内,在各种组织和器官都保持完整的情况下能够观察干细胞的行为和生物学特性,则会大 力促进基于干细胞的各种疾病治疗方法的研究工作.目前已对多种干细胞进行了大量的研 究,动物模型研究方法也很多,但典型的方法还是在移植后的几星期或几个月,通过解剖 实验动物以了解干细胞的功能.但采用这种研究方式,就无法得到移植后一些关键性的实 验数据,例如,移植后的前几个小时到几天时间造血干细胞在脾和骨髓的定位和增值情 况;

移植后造血干细胞在动物体内的迁移情况等.体内可见光成像技术,主要是生物发光 成像(in vivo bioluminescence Imaging,BLI)技术作为一种新型成像技术,在最近几年已 被广泛应用于在多种动物模型中示踪肿瘤细胞、造血干细胞,淋巴细胞,病原菌和病毒. 本节简要介绍体内可见光成像技术成像原理,成像系统使用方法和在干细胞研究方面的应 用. 一,体内可见光成像技术成像原理 体内可见光成像技术是采用荧光素酶(luciferase)基因(Luc)标记细胞和基因,利用 一套非常灵敏的光学检测仪器,让研究人员能够直接监控活体生物体内的细胞活动和基因 行为.传统的动物实验方法需要在不同的时间点宰杀实验动物以获得数据, 得到多个时间 点的实验结果.相比之下,体内可见光成像通过对同一组实验对象在不同时间点进行记 录,跟踪同一观察目标(标记细胞及基因)的移动及变化,所得的数据也更加真实可信. 另外, 这一技术由于不涉及放射性物质,具有操作简单,所得结果直观,灵敏度高等特点, 在刚刚发展起来的几年时间内,已广泛应用于生命科学、医学研究及药物开发等方面. 1. 细胞标记

1995 年,Contag 首次在小动物体内检测到带有 lux 操纵子的病原菌发出的可见光.他 是通过 CCD 相机捕捉到这个被感染动物的生物发光现象的.在1997 年,他又首次观察到 表达荧光素酶的转基因小鼠在注入荧光素酶底物后的生物发光现象[1].自此,细菌及萤 火虫荧光素酶被广泛应用于小动物体内可见光成像技术. 哺乳动物生物发光,是将 Luc 基因整合到细胞染色体 DNA 上以表达荧光素酶,当外 源(腹腔或静脉注射)给予其底物荧光素(luciferin),即可在几分钟内产生发光现象.这 种酶在 ATP,氧存在的条件下,催化荧光素的氧化反应才可以发光,因此只有在活细胞 内才会产生发光现象,并且发光光强度与标记细胞的数目线性相关.对于细菌,lux 操纵 PDF 文件使用 pdfFactory 试用版本创建 www.fineprint.com.cn 龙脉得生物技术有限公司 Longmed, Inc. http://www.longmed.com 子由编码荧光素酶的基因和编码荧光素酶底物合成酶的基因组成,带有这种操纵子的细菌 会持续发光,不需要外源性底物(见图 1). 图1可见光成像原理.将荧光素酶基因连接于启动子下游,稳定整合到细胞染色体内,使荧光素酶得到持续表 达.在体内,荧光素酶在 ATP、氧气存在的条件下,与外源注入的特异底物反应产生发光现象.因此仅在活细胞内才 会出现荧光,且发光强度与标记细胞数目线性相关. 基因、细胞和活体动物都可被荧光素酶基因标记.标记细胞的方法基本上是通过分子 生物学克隆技术, 将荧光素酶的基因插到预期观察的细胞的染色体内,通过单克隆细胞技 术的筛选, 培养出能稳定表达荧光素酶的细胞株.目前, 常用的肿瘤细胞株基本上都已标记 好, 市场上已有销售. 而对于非永生系细胞,如干细胞和淋巴细胞,可采用病毒转染或者 利用转基因动物方式获得标记细胞.将标记好的细胞接种到实验动物体内后, 观测前需要 注射荧光素酶的底物―荧光素.荧光素是

280 道尔顿的小分子,其脂溶性非常好, 能很容 易地透过血脑屏障.注射一次荧光素能保持小鼠体内荧光素酶标记的细胞发光 30-45 分钟.每次荧光素酶催化反应只产生一个光子,这是肉眼无法观察到的,精诺真公司 (Xenogen Corp.)生产的 IVIS 成像系统,应用一个高度灵敏的制冷 CCD(Charge Coupled Device)相机及特别设计的成像暗箱和成像软件,可观测并记录到这些光子(见图2). 图2体内可见光成像系统组成.A. 细胞、病原体及病毒均可被荧光素酶标记.B.小鼠携带标记的细胞及基因.C.在暗 箱中由 CCD 相机记录生物发光.D.由成像软件定量、分析所得数据. 2.不同波长可见光穿透动物组织能力不同 PDF 文件使用 pdfFactory 试用版本创建 www.fineprint.com.cn 龙脉得生物技术有限公司 Longmed, Inc. http://www.longmed.com 光在哺乳动物组织内传播时会被散射和吸收,光子遇到细胞膜和细胞质时会发生折射 现象,而且不同类型的细胞和组织吸收光子的特性并不一样.血红蛋白(hemoglobin)是 造成体内可见光被吸收的主要因素,其吸收可见光中蓝绿光波段的大部分.但是在可见光 大于600纳米的红光波段,血红蛋白的吸收作用却很小.因此,在偏红光区域, 大量的光可 以穿过组织和皮肤而被检测到,如图3所示.利用精诺真公司的IVIS系统最少可以看到皮 下的500个细胞,当然,由于发光源在老鼠体内深度的不同,在不同情况下可看到的最少 细胞数是不同的.在相同的深度情况下, 检测到的发光强度和细胞的数量具有非常好的线 性关系.体内可见光成像技术的基本原理在于光可以穿透实验动物的组织并且可由仪器量 化检测到的光强度,同时反映出细胞的数量. 图3在波长大于 600nm 时,由老鼠体内发出的光是可以穿透皮肤被检测到. 3. 技术特性 相比较于目前的活体生物成像技术,如超声(Ultrasound)、计算机断层摄影 (Computed Tomography ,CT)、核磁共振(Magnetic Resonance Imaging ,MRI)、正 电子衍射成像(Positron-Emission Tomography,PET)、单光子衍射(Single-Photon- Emission Computed Tomography, SPECT)等技术,体内可见光成像技术(Optical Imaging)包 括生物发光 (Bioluminescence) 与荧光(Fluorescence)具有许多独特的优点:操作简 便,测量快速(短于

5 分钟),同时可检测多个动物,费用低廉等. 1)与荧光成像技术的比较[2] 荧光发光需要激发光使得荧光团达到较高的能量水平,然后发射出较长波长的发射 光.两种常见的荧光蛋白:绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)和红色荧光蛋 白(Discosoma red fluorescent protein, DsRed)的发射光局限于可见光 400-650nm 范围. 生物体内很多物质在受到激发光激发后,也会发出荧光,产生的非特异性荧光会影响到检 测灵敏度.特别是当发光细胞深藏于组织内部,则需要较高能量的激发光源,也就会产生 很强的背景噪音. PDF 文件使用 pdfFactory 试用版本创建 www.fineprint.com.cn 龙脉得生物技术有限公司 Longmed, Inc. http://www.longmed.com 生物发光成像相对于荧光成像,其灵敏度高.作为体内报告源,生物发光较之荧光的 优点之一为不需要激发光的激发, 它是以酶和底物的特异作用而发光, 且动物体自身不会发 光,这样生物发光就具有极低的背景.虽然荧光信号强度远远超过生物发光,但极低的自 发光水平使得生物发光的信噪比远高于荧光.另外, 生物发光信号可以方便计量,即使标 记细胞在动物体内有复杂的定位,亦可从动物体表的信号水平直接得出发光细胞的数量 (图4).而对于荧光,信号水平取决于发光细胞的数量及激发光的强度,而光线穿过的 组织对其有强烈的吸收,这使得荧光强度很难计量.荧光素酶在表达后快速合成并具有较 短的寿命(荧光素酶在体内的半衰期为

3 小时),作为报告基因可实时反应细胞数量或启 动子起始转录过程效率的变化.可根据两者所具有的特点以及实验要求如组织的光学条件 (报告源的深度、体积及组织吸光度等),选择所适合的发光探针. 图4生物发光检测和荧光检测的比较 2)功能成像与结构成像 MRI/CT 系统通常仅提供结构信息,无法区分细胞的不同的生理状态(如细胞是存活 还是死亡),而体内可见光成像不仅可以定位信号,更可得出有代谢活性细胞的数量.对 于不能应用 MRI/CT 检测的软组织及细菌被检物,采用可见光成像技术均可灵敏检测.而且,将组织特异性基因启动子连接于生物发光或荧光报告基因,可以检测该基因的表达及 功能,开启了以发光转基因动物为模型的新研究领域. PDF 文件使用 pdfFactory 试用版本创建 www.fineprint.com.cn 龙脉得生物技术有限公司 Longmed, Inc. http://www.longmed.com 二. 仪器结构及参数 以精诺真公司的 IVIS

100 系统(图5)为例, 体内可见光成像系统主要由三部分组成: 图5IVIS

100 成像系统包括: CCD 数码相机及成像暗仓,配备活体成像软件及高清晰度监视器的计算机,低温制冷系 统,以及相机控制器. 1)CCD 镜头 选择适当的 CCD 镜头,对于体内可见光成........