PDF《新疆阿克苏地区温宿县稻田养鸭肝炎 病毒的分离与鉴定》

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0 1

9 ) 收稿日期:

2 0

1 6-

1 1-

0 3 ;

修回日期:

2 0

1 6-

1 1-

2 3 基金项目: 新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技兵团重点实验室 基金项目( H S

2 0

1 6

0 8 ) 作者简介: 武军元(

1 9

8 0- ) , 男, 副教授, 博士, 研究方向为 人兽共患病学, w j y n - w @1

2 6 . c o m . 新疆阿克苏地区温宿县稻田养鸭肝炎 病毒的分离与鉴定 武军元1 , 黄忠武2 , 康强3 , 姚礼文4 (

1 . 塔里木大学, 新疆 阿拉尔

8 4

3 3

0 0 ;

2 . 新疆库车县动物疾病预防控制中心, 新疆 库车

8 4

2 0

0 0 ;

3 . 阿克苏地区动物疫病控制诊断中心, 新疆 阿克苏

8 4

3 0

0 0 ;

4 . 新疆阿瓦提县畜禽改良站, 新疆 阿瓦提

8 4

3 2

0 0 ) 中图分类号: S

8 5

2 .

6 5 +

7 ;

S

8 5

8 .

3 2 文献标识码: B 文章编号:

1 0

0 4-

7 0

3 4 (

2 0

1 6 )

1 2-

0 0

0 8-

0 3 关键词: 水稻鸭;

鸭肝炎病毒;

R T- P C R ;

进化分析;

基因 C型摘要: 为了进一步明确

2 0

1 5年新疆温宿县水稻林场某养殖户水稻鸭出现的一种以肝脏出血、 肿大 为主要病变特征的传染病病因, 试验采用分子生物学方法, 将病变肝脏组织匀浆处理接种鸭胚增殖后 经RT- P C R进行鉴定.结果表明: 分离毒株 D H V/ X J

2 0

1 5与传统Ⅰ型鸭肝炎病毒 D H V之间的相似 性较低, 为65.6%~66.7%, 而与韩国新型 D H V之间的亲缘关系较近, 相似性高达

9 1 .

9 % ~

9 6 .

6 %. 说明本试验所分离毒株属于新的基因 C型鸭肝炎病毒. 鸭病毒性肝炎( D V H ) 是一种急性接触传染病, 以发病急、 传播快、 病死率高为特征, 病鸭多呈角弓反 张样外观, 并伴有肝脏特征性出血病变[

1 -

2 ] .该病的 病原为鸭肝炎病毒( D H V ) , 无血凝特性, 分为 D H V- Ⅰ、 D H V- Ⅱ 及DHV-Ⅲ 三个血清型, 均被划分为 小RNA病毒科.目前 D H V-Ⅱ和DHV-Ⅲ重新被 划分为禽的星状病毒[

3 ] .但是, 近年来国外相继出 现有关 新型DHV( N-D H V ) 的报道, C . H . T s e n g 等[

4 ] 首先证实, 台湾分离毒株(

0 4 G和90D)的基因 组序列不同于血清Ⅰ型DHV.M. C . K i m等[

5 ] 也报 道了不同于血清Ⅰ型DHV的韩国分离株.因此, 有 学者建议将 D H V中小 R N A病毒科禽肝病毒属的成 员称为鸭甲肝病毒( D H A V ) , 根据其基因结构又分为 A 、 B 、 C三个基因型[

6 ] .血清Ⅰ型、 台湾新型和韩国 新型等 D H V在进化分析中属于三个不同的基因型, 即血清Ⅰ型(基因 A型) 、 台湾新型 ( 基因 B型) 和 韩国新型 ( 基因 C型) .苏敬良等[

7 ] 、 施少华等[

8 ] 和 范书才等[

9 ] 也先后从广西等地分离到与 D H V- Ⅰ型 无血清学相关的 D H V , 初步说明在我国大陆流行的 D H V- Ⅰ已经发生了变异.2

0 1 5年 9月份, 新疆温 宿县水稻林场某养殖户接种 D H V- Ⅰ疫苗的水稻鸭 出现大批雏鸭死亡的现象, 发病雏鸭多呈角弓反张现 象, 剖检可见肝脏明显的出血点或出血斑, 为探明其 发病原因, 笔者对该病的病原进行了分离鉴定.

1 材料

1 .

1 病料来源

2 0

1 5年 9月份, 温宿县水稻林场 7~

1 2日龄死 亡樱桃谷鸭, 病鸭呈角弓反张样外观, 剖检可见肝脏 肿大, 呈黄红色或花斑状, 表面有出血点和出血斑. 无菌采集病死鸭肝脏进行病原检测.

1 .

2 病毒增殖用鸭胚 9日龄健康鸭胚, 购自当地某种鸭场. ・

8 ・

2 0

1 6 (

1 2下) : 8-

1 0

1 .

3 主要试剂 T R I z o l , I n v i t r o g e n公司提供;

反转录酶 M- M L V 、 T a qD N A聚合酶、 p M D1 8-T载体、 d N T P , 购自宝生 物工程( 大连)有限公司;

T I A N p r e pM i n i P l a s m i dK i t 质粒提取试剂盒、 T I A N q u i c kM i d i P u r i f i c a t i o nK i t 纯化 试剂 盒, 购自天根生化科技(北京)有限公司;

T r a n s

2 KP l u s D N AM a r k e r , 购自北京全式金生物技术 有限公司.

2 方法

2 .

1 病毒分离 无菌采集呈典型鸭肝炎病变的死亡雏鸭的肝脏, 剪碎后按照组织重量以

1 ∶ 4比例加入青霉素和链霉 素双抗(

1 0 0m g / m L ) 至终点浓度

1 00

0 0U/ m L , 高速 匀浆制成肝脏组织乳剂, 反复冻融3次,

1 20

0 0r / m i n 离心

1 5m i n ,取上清液,用孔径为0.22μ m的细菌滤器过滤除菌,取无 D H V母源抗体 的10日龄鸭胚

1 0枚, 经尿囊腔途径接种过滤除菌的 匀浆病料,

0 . 2m L / 胚, 接种后继续孵化, 收获

2 4~

7 2h死亡的鸭胚尿囊液, 冷冻保存, 备用, 将分离病 毒命名为 D H V/ X J

2 0

1 5 .

2 .

2 鸭胚尿囊液细菌鉴定 将收获的鸭胚尿囊液划线接种于普通琼脂平板 和TSA平板, 分别于

3 7℃在CO2培养箱和恒温箱中 倒置培养

4 8h , 观察有无细菌生长.

2 .

3 血凝试验 按照常规方法进行微量血凝试验, 测定分离毒株 有无血凝特性.

2 .

4 R T- P C R鉴定 参考 G e n B a n k 中收录的新型 D H V基因序列, 利用Primerpremier5.0软件设计 1对检测引物: 上游 引物:

5 ′ -C T T G G T G A A A C A T C T C T T T G G T C G-

3 ′ ;

下 游引 物:

5 ′- A G T C C A T G T G G A A C A C A A C A T T G C-

3 ′ .扩增片段的大小为

12 5 9b p , 包含有 V P I 结构蛋 白全基因, 引物由生工生物工程( 上海) 股份有限公 司合成.按照 T R I z o l 试剂盒说明书从收获的鸭胚尿 囊液中提取 R N A , 按反转录说明书的操作方法, 以Randomh e x a m e r s 为反转录引物合成病毒基因组的 c D N A .反转录之后按以下的体系及程序进行 P C R 测定:

1 0*T r a n sT a qB u f f e r 5μ L ,

2 . 5m m o l / Ld N T P m i x t u r e 2μ L , 上、 下游引物(

1 0p m o l / μ L )各4μ L , T r a n s T a q 酶1μ L , 反转录产物 4μ L , d dH

2 O补齐至

5 0μ L , 然后

9 4℃ 5m i n ,

9 4℃

4 5s ,

5 3℃

3 0s ,

7 2℃

1 . 5m i n , 共35个循环, 最后

7 2℃

1 0m i n , 保存于 4℃冰箱中. P C R产物用

1 . 0%( W/ V )琼脂糖凝胶 电泳检测, 电泳完成后切下目的片段, 用TIANquickMidiPurificationK i t 纯化回收 D N A .

2 .

5 克隆测序 回收目的片段并连接到 p M D

1 8-T载体,转化 入DH5a感受态细胞,涂布于含氨苄青霉素的 L B平 板上,

3 7℃培养

1 2~

1 6h ,挑取单个菌落接种于含 氨苄青霉素的 L B液体培养基,

3 7℃

2 0 0r / m i n振荡 过夜, 提取质粒进行双酶切, 鉴定正确的重组质粒取

1 5μ L送生工生物工程测序部进行序列测定.

2 .

6 序列分析 应用 D N A M A N软件将获得的测序结果进行拼接 与分析, 用MEGA5 . 0软件对拼接的序列和 G e n B a n k 中登录的 D H V参考病毒株进行序列比对, 计算基因 遗传距离并绘制进化关系发生树, 分析所用病毒及其 G e n B a n k 登录号, 见表

1 . 表1分析所用病毒及其 G e n B a n k登录号 分离株 缩写 登录号 D u c kh e p a t i t i sv i r u sn e ws e r o t y p e ( G ) G E U

7 5

5 0

0 9 D u c kh e p a t i t i sv i r u sn e ws e r o t y p e ( G D ) G D G Q

1 2

2 3

3 2 D u c kh e p a t i t i sv i r u sn e ws e r........