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分类号: 密级: U D C: 华东理工大学学位论文树脂枝孢霉菌 Amorphotheca resinae ZN1 生物降解木质纤维素来源呋喃醛 和芳香醛的实验研究 冉红 指导教师姓名: 鲍杰 教授 华东理工大学生物工程学院 申请学位级别: 硕士 专业名称: 生物化工 论文定稿日期: 2014.

04.15 论文答辩日期: 2014.05.23 学位授予单位: 华东理工大学 学位授予日期: 答辩委员会主席: 评阅人: 作者声明我郑重声明:本人恪守学术道德,崇尚严谨学风.所呈交的学位论文,是本人在导 师的指导下,独立进行研究工作所取得的结果.除文中明确注明和引用的内容外,本 论文不包含任何他人已经发表或撰写过的内容.论文为本人亲自撰写,并对所写内容 负责. 论文作者签名:

2014 年月华东理工大学硕士学位论文 第I页树脂枝孢霉菌 Amorphotheca resinae ZN1 生物降解木质纤维素来源呋喃醛 和芳香醛的实验研究 摘要 呋喃醛和芳香醛类抑制物是木质纤维素预处理过程中产生的对酶水解和发酵过程 有严重抑制作用的副产物.脱毒真菌 Amorphotheca resinae ZN1 具有高效降解这些木 质纤维素衍生物的能力已得到证实,经A. resinae ZN1 脱毒后极大地提高了后续发酵 过程中生物乙醇及生物化学品的得率.本文通过改变发酵条件研究 A. resinae ZN1 降 解呋喃醛中糠醛和 5-羟甲基糠醛(5-HMF),芳香醛中香草醛、松柏醛、丁香醛和 4-羟 基苯甲醛的代谢路径及代谢性能.实验发现对于呋喃醛类物质: (1)在氧气存在的条件 下,A. resinae ZN1 将糠醛/5-HMF 同时转化为糠醇/5-羟甲基糠醇和糠酸/5-羟甲基糠 酸.无氧时糠醛/5-HMF 只被降解为糠醇/5-羟甲基糠醇;

(2)氧气存在时,葡萄糖能够 增加糠醛和 5-HMF 的降解速率;

(3)在有氧条件下,当糠醛/5-HMF 浓度降低到阀值时, 葡萄糖才会降解.对于芳香醛(香草醛、松柏醛、丁香醛和 4-羟基苯甲醛)类物质: (1) 在氧气存在的条件下,A. resinae ZN1 将芳香醛类物质同时转化为相应的芳香醇和芳香 酸.在无氧条件下,芳香醛类物质基本不被降解;

(2)在含氧培养基中,葡萄糖抑制香 草醛、松柏醛和 4-羟基苯甲醛的降解,却极大程度的促进丁香醛的转化;

(3)高浓度的 香草醛和松柏醛抑制葡萄糖的降解,而高浓度的 4-羟基苯甲醛/丁香醛可以和葡萄糖同 时被 A. resinae ZN1 降解.本文以实验为基础,给出 A. resinae ZN1 对呋喃醛和芳香 醛类物质的代谢路径及降解性能, 为提高生物脱毒效率及脱毒菌株的发展提供重要的信 息. 关键字:木质纤维素;

脱毒;

呋喃醛;

芳香醛;

代谢路径 第II 页 华东理工大学硕士学位论文 Experimental Study of Biodegradation of Furan Aldehydes and Aromatic Aldehydes Derived from Lignocellulose by Amorphotheca resinae ZN1 Abstract Furan aldehydes and aromatic aldehydes are degradation products of lignocellulose during pretreatment operations. The two aldehydes compounds significantly inhibit the consequent enzymatic hydrolysis and fermentation processes. The biodetoxification fungus Amorphotheca resinae ZN1 had demonstrated its excellent capacity on degrading lignocellulose derived inhibitors and helped the fermentation processes to achieve high yield of ethanol and biochemicals. The degradation pathways and performance of furan aldehydes (furfural and 5-hydroxymethylfurfural) and aromatic aldehydes (vanillin, coniferyl aldehyde, syringaldehyde and 4-hydroxybenzaldehyde) by A. resinae ZN1were investigated by changing various culture conditions. In this thesis, the phenomenons of furan aldehydes degradation was investigated. The results include: (1) A. resinae ZN1 converts furfural/5-HMF into furfuryl/5-HMF alcohols and furoic/5-HMF acids simultaneously at aerobic condition, and only the corresponding furfuryl/5-HMF alcohols are obtained at anaerobic condition;

(2) the existence of glucose accelerates the degradation rate of furfural and HMF by A. resinae ZN1 and the cell mass growth rate at aerobic culture;

(3) glucose is not consumed before furfural or 5-HMF is degraded to a low threshold concentration when oxygen exist in tne culture. For degradation of aromatic aldehydes (vanillin, coniferyl aldehyde, syringaldehyde and 4-hydroxybenzaldehyde), the reults include: (1) A. resinae ZN1 converts aromatic aldehydes into aromatic alcohol and aromatic acid simultaneously at aerobic condition, and aromatic aldehydes was not to be degraded without oxygen;

(2) glucose inhibits the degradation of vanillin, coniferyl aldehyde, 4-hydroxybenzaldehyde, but improves the degradation rate of syringaldehyde at aerobic condition;

(3) the high concentration of vanillin and coniferyl aldehyde inhibit the conversion of glucose, but the high level of 4-hydroxybenzaldehyde and syringaldehyde are degraded with glucose at the same time. The pathways of furan aldehydes and aromatic aldehydes were proposed based on the experimental reults. This work provides important information for detoxification enhancement and strain modification. Key words: lignocellulose;

detoxification;

furan aldehydes ;

aromatic aldehydes;

pathways 华东理工大学硕士学位论文 第III页 目录 引言.1

第一章 文献综述.2 1.1 生物乙醇的研究现状.2 1.2 木质纤维素的组成及预处理方法的研究.2 1.3 木质纤维素预处理过程中形成的抑制物.4 1.4 抑制物的抑制作用及机理.7 1.4.1 呋喃醛的抑制作用及机制.7 1.4.2 有机酸类物质的抑制作用及机制.8 1.4.3 芳香醛的抑制作用及机制.10 1.5 现有的脱毒方法.11 1.5.1 物理脱毒法.12 1.5.2 化学脱毒法.12 1.5.3 生物脱毒法.12 1.6 脱毒菌株代谢抑制物路径的研究.17 1.6.1 呋喃醛类抑制物的代谢路径研究.17 1.6.2 芳香醛类物质的代谢路径研究.20 1.6.3 有机酸类抑制物的代谢路径研究.20 1.7 树脂枝孢霉 Amorphotheca resinae ZN1 的研究.20 1.8 选题依据及研究现状.21 第2章材料和方法.23 2.1 菌株、试剂与仪器设备.23 2.1.1 菌种.23 2.1.2 实验试剂及仪器.23 2.1.3 种子培养基和发酵培养基.23 2.2 实验方法.25 2.2.1 菌种保藏.25 2.2.2 种子活化.25 2.2.3 发酵种子的培养.26 2.2.4 呋喃醛类物质的上罐实验.26 2.2.5 芳香醛类物质的 GC-MS 样品准备.26 2.2.6 芳香醛类物质的发酵实验.27 2.3 分析方法.28 第3章A. resinae ZN1 的呋喃醛代谢路径研究

29 第IV 页 华东理工大学硕士学位论文 3.1 A. resinae ZN1 降解糠醛和 5-HMF 的空白对照实验

29 3.2 A. resinae ZN1 在以糠醛或 5-HMF 为唯一碳源的无氧降解研究

32 3.3 A. resinae ZN1 在不同通气量中以糠醛为唯一碳源的降解研究

33 3.4 A. resinae ZN1 在通气量不同时以 5-HMF 为唯一碳源的降解研究

35 3.5 A. resinae ZN1 在含葡萄糖的培养基中对糠醛和 5-HMF 的无氧降解研究 .....

36 3.6 不同通气量对 A. resinae ZN1 在含葡萄糖的培养基中对糠醛降解的影响.....

37 3.7 不同通气量对 A. resinae ZN1 在含葡萄糖的培养基中对 5-HMF 降解的影响...

39 3.8 A. resinae ZN1 对糠醛和 5-HMF 代谢路径及代谢性能分析

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第四章 A. resinae ZN1 的芳香醛代谢路径研究

43 4.1 A. resinae ZN1 降解芳香醛的空白对照实验及 GC-MS 分析

43 4.2 A. resinae ZN1 对香草醛降解路径的研究

45 4.3 A. resinae ZN1 对松柏醛降解路径的研究

47 4.4 A. resinae ZN1 对丁香醛降解路径的研究

49 4.5 A. resinae ZN1 对4-羟基苯甲醛的降解路径的研究.51 4.6 A. resinae ZN1 对芳香醛类物质代谢路径的分析

53 第5章结论与展望.57 5.1 结论.57 5.2 展望.57 参考文献.58 致谢.63 华东理工大学硕士学位论文 第1页引言 木质纤维素生物质如农业残留(小麦秸秆和玉米芯) ,木头及能源作物是地球上丰 富的可再生性资源, 而成为生产生物乙醇最有前景的原料. 但是由于它的组成结构复杂, 对外界的物理、化学和生物作用有很强的抵抗力,所以在发酵前必须经过预处理步骤. 然而,几乎所有的预处理方法都不可避免的产生各种类型的副产物.这些副产物主要包 括三大类:呋喃醛、芳香醛和有机酸,它们对后续发酵微生物都有强烈的抑制作用,这 些物质的存在会使乙醇生产菌株的发酵性能下降. 常用的一些物理和化学脱毒法虽然能 将这些抑制物降解,但通常会致使大量木质纤维素有效成分的损失,并且产生大量的废 水.生物脱毒法由于条件温和,能完全降解预处理后木质纤维素原料中的抑制物,糖类 损失小和基本没有废水产生等优点而备受关注. 本实验室从预处理后的秸秆中筛选得到 一株具有较强代谢抑制物能力的树脂枝孢霉菌―Amorphotheca resinae ZN1,它能够快 速降解预处理后的木质纤维素原料中的呋喃醛,芳香醛和有机酸类抑制物.实验室之前 对于 A. resinae ZN1 的研究主要集中在它对抑制物的降解效率上,关于它作为脱毒菌 株降解这些抑制物的代谢路径和代谢机理并没有做过研究. 因此本研究选取木质纤维素 中典型的呋喃醛(糠醛和 5-HMF)和芳香醛(香草醛、松柏醛、丁香醛和 4-羟基苯甲醛) 类物质为研究对象,通过改变通气状况和葡萄糖的量来研究 A. resinae ZN1 降解这些 抑制物代谢路径和 A. resinae ZN1 代谢性能.通过对降解产物的检测和实验现象的分 析,得到了 A. resinae ZN1 代谢呋喃醛和芳香醛的代谢路径和氧气及葡萄糖对于代谢 路径的影响. 第2页华东理工大学硕士学位论文

第一章 文献综述 1.1 生物乙醇的研究现状 生物乙醇作为汽车燃料是现阶段使用最广泛的生物能源, 随着全球变暖和化石能源 减少等问题,生物乙醇的重要性已慢慢凸显出来.许多国家都在政策和经济上给予生物 质生产生物乙醇了许多支持. 全球生物乙醇市场已进入一个快速的、 过渡的增长阶段 [1,2] . 多种不同的生物质,如农作物小麦、玉米、甘蔗等和一些农作物残留如小麦秸秆、玉米 芯、甘蔗渣等都可以通过不同的生物转化工艺生产生物乙醇.粮食作物生产生物乙醇只 在少数国家实现了工业化,像巴西主要使用甘蔗为原料生产生物乙醇,而美国则通过玉 米发酵生产生物乙醇 [3,4] .美国

2010 年的乙醇产量达到 128.2 亿加........