PDF《如何使用SpectraMax® M5 多功能微孔板读板机》

材料 如何使用SpectraMax? M5 多功能微孔板读板机 和IMAP? 荧光偏振检测平台进行激酶活性的分析 By Cathy Olsen, Ph.

D., Molecular Devices Corporation,

1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089. 介绍 SPECTRAMAX APPLICATION NOTE #6 蛋白激酶在调节许多细胞反应过程时起着核 心的作用.近年来已经成为癌症和其它许多 疾病药物重要的作用靶点.IMAP是Molecular Devices 公司推出一种快速、非 放射性的激酶检测技术,由于技术本身特点 其非常适合用于进行试验优化和高通量的筛 选. IMAP检测技术基于的原理是磷酸根离 子与表面固化有三价金属离子的纳米球颗粒 的一种结合作用.当这种结合反应发生后, 荧光标记的多肽分子的运动轨迹发生了改 变,荧光标记复合物的荧光偏振值就会增加 (SeeFigure 1.).因为是一种均相的,可忽 视底物多肽序列的一种检测方法,所以可广 泛的应用于多种激酶的检测. 当使用 IMAP技术进行试验优化和高通量的 筛选时,SpectraMax M5多功能微孔板读 板机可作为其非常理想的、可靠的检测平 台.SpectraMax M5是一种基于光栅型单 色器的多功能微孔板读板机,允许使用者针 对不同的荧光染料分子随意选择不同的检测 波长,而无需额外再选购滤光片配件.这篇 应用文章详细的描述了在进行IMAP荧光偏 振激酶试验时,如何使用SpectraMax M5 多功能微孔板读板机和 SoftMax? Pro 软件 进行检测和分别对红色及绿色荧光底物来校 正曲线.LCK是一种酪氨酸酶,在T细胞信 号转导通路中发挥着非常关键作用,制备其 稀释曲线.另外Akt1/PKBa,一种丝氨酸- 苏氨酸激酶,参与磷脂酰肌醇激酶3的信号 转导和细胞活力.通过十字孢碱抑制Akt1/PKBa的试验中,计算FAM和TAMRA分别标记的多肽底物在反应过程始 中获得的Z'

因子值,其结果与滤光片式多功 能微孔板读板机上获得的结果相一致. I M A P 快速筛选试剂盒(MolecularDevices Cat. #R8125) .IMAP结合试剂 .IMAP 结合缓冲液 A (5X) .IMAP结合缓冲液B (5X) .IMAP反应缓冲液(5X) LCK激酶(Upstate Cat. #14-442) . 标记FAM-p34cdc2多肽底物(Molecular Devices Cat. #R7157) .标记TAMRA-p34cdc2多肽底物 (Molecular Devices Cat. #R7309) .标记FAM-p34cdc2来源的磷酸化多 肽校正试剂(Molecular Devices Cat. #R7271) Akt1-PKBa 激酶 (Upstate Cat. #14-276) .FAM标记多肽底物 (Molecular Devices Cat.#R7110) . F A M 标记的磷酸化多肽底物(Molecular Devices Cat. #R7159) 方法 激酶反应 IMAP FP KINASE ASSAYS ON THE SPECTRAMAX M5 MULTI-MODE MICROPLATE READER 校准标准品的制备 Table 1. Preparation of Calibration Standards Calibration Standard (% Phosphorylated) ?L Peptide Stock ?L Phospho- peptide Stock

0 100

0 12.5 87.5 12.5

25 75

25 50

50 50

100 0

100 结合反应 Table 2. IMAP FP Settings in SoftMax Pro for SpectraMax M5 Microplate Reader Read type Endpoint Read mode Fluorescence polarization Wavelengths FAM Ex

485 nm Em

525 nm Cutoff

515 nm TAMRA Ex

530 nm Em

590 nm Cutoff

570 nm Sensitivity Readings:

100 PMT: high or medium Automix Off AutoCalibrate On Assay plate type 384-well Costar black Wells to read [Determined by user] Settling time Delay:

100 ms AutoRead Off 贮存在纯水中的50 mM Adenosine 5'

triphosphate (ATP)(Sigma Cat. #A6559) 贮存在纯水中的100 mM DL-Dithiothreitol (DTT)(Sigma Cat. #D9779) 十字孢碱 (Staurosporine) Biomol Cat. #EI-156) 黑色聚苯乙烯材质的384孔板(Corning Cat. #3710) 预装有SoftMax Pro软件电脑及连接 SpectraMax M5 多功能微孔板读板机 (Molecular Devices) 步骤1.在1xIMAP反应缓冲液中加入DTT, 并使DTT得终浓度达到1mM(1:100稀释100mM的DTT贮存液),得到完整 的反应缓冲液(CRB);

步骤2.在CRB中制备400nM(4x)的FAM或TAMRA标记的多肽底物(1:50稀释原 20uM的多肽贮存液);

步骤3.在CRB中制备20uM(4x)的ATP (1:2500稀释原50mM的ATP贮存 液);

步骤4.准备一份终浓度为4x的酶梯度稀释 液.对于激酶抑制剂试验,使用恒定 浓度的酶,并制备出一组十字孢碱或 其它激酶抑制剂的梯度稀释液. 步骤5.将下列试剂平行的加入4个复孔的激 酶反应体系中: 5ul CRB或十字孢碱 5ul酶(对于没有添加酶的背景孔, 加入5ul CRB作为替代) 5ul 20uM的ATP贮存液 5ul

400 nM的多肽贮存液 步骤6.室温孵育1到1.5小时. Note:如需获得更为详尽的说明,请参考 IMAP product insert 1.另外,对于多种激酶 的试验数据也可以登录以下网址进行查寻 http://www.moleculardevices.com/assaya rchive/ Note:更多校正曲线配制及使用信息,请 参考IMAP Application Note #4, Devel- oping Calibration Curves for IMAP2. 步骤1.在CRB中制备一份100nM的多肽贮 存液(使用与激酶试验中相同的底物);

步骤2. 在CRB中制备一份100nM的磷酸多 肽贮存液(使用与激酶试验中相同的磷 酸化底物);

步骤3.如

图表1所示将多肽和磷酸化多肽贮 存液按照一定规律混合后,制备校正 标准品.样品量足够4个复孔所需;

步骤4.各移出20ul校正标准品到4个复孔 中,包括一组只有20ul CRB的空白背 景样本. 步骤1.打开SoftMax Pro软件上针对荧光素 使用的IMAP 荧光偏振模板.FAM和TAMRA模板已预设好;

如果使用的 不是FAM和TAMRA荧光素,只需调 整波长设置即可.对于SpectraMax M5多功能微孔板读板机上的参数设置 见

图表2. 步骤2.设置一个试验模板,选定背景样品 本孔、激酶样品本孔、校正标准品 孔.激酶试验样品和校正标准品可分 到SoftMax Pro软件模板上预设好的8 个样本组中.在计算最小偏振值(mP)之前,首先将只含有缓冲液的 质控品分到相应的背景组中后,使用 软件自动扣除其背景荧光值. 步骤1.将75%的结合缓冲液A与25%的结 合缓冲液B混合,制备结合缓冲液;

步骤2.将结合试剂以1:600倍稀释成结合缓 冲液,得到结合反应液;

步骤3.移出60ul结合反应液到每个检测孔 和校正标准孔中(包括背景孔样本) 步骤4.室温避光孵育1小时;

在SoftMax Pro软件上设置模板,并在 SpectraMax M5多功能微孔板读板机上进 行读数 Note:FAM和TAMRA标记底物的IMAP 荧光偏正实验的模板在SoftMax Pro

5 软 件上已预设好,详见Binding Assays模 板文件夹. 结果 SPECTRAMAX APPLICATION NOTE #6 步骤3.把微孔板放到读板机里后---确保紫 色托架(适配器)放置在微孔板托架 上---然后点击Read读板. SoftMax Pro........