PDF《祁自柏》

功一唧第15卷第2 期200o年 6月中国病毒学V【ROLOG 【 CA S【 N 【 CA Vo I _

1 5 No

2 J u n.

2 0

0 0 丙型肝炎病 毒Core与 N S 3基因的不 同融 合方式及其 表达簦,,

祁自 柏(中国 科学 院武 祝病 毒研究所 , 武汉

4 3

0 0

7 1 ) ( 中 国药 品 生物制 品捡 定所 . 北京 l

0 0

0 5

0 ) 关 簟调 : 丙 型肝 炎病毒;

Core基 因;

NS 3基因中囝分 类号;

R5

1 2 .

6 3 文献 标讲码:A型;

墼文章 编号:1003―5

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2 . , j 鹧7 ;

.

2 J 丙 型肝 炎病 毒(简称 HC V) 是危害人 类 健康 的传染性 疾病 . 预 防该 病的传播 主要 借助 于HC V血清 学诊 断来 筛选献血 员和检 测临床 标本.从 国内外 已分离 到的HC V 株得知, HC V 核 心蛋 白( C o r e ) 和 非结构 蛋白NS 3含有 较 强的优 势抗 原 表位 , 其相应的抗 体 出现 早.阳性 率高 . 已成为 目前 第

二、第三代 HC V免 疫诊断 试剂 的 重要 成份【

1 .

2 ] .通常Core蛋 白和 NS 3蛋 白分 别用基 因工 程 方法表达 , 然后作 为 固定化抗 原.检测 人体 内HC V 的抗 体 .我 们对 C o r e 和NS

3 的两种 不同组 合方式 及其表达 的研 究. 对 于发展 新的HC V 诊断 试剂 很有帮助 . 现将结果报 道如下.I材料和 方法

1 .

1 质 粒与 菌种古HC V 的Core基因表达质粒

0 HC Vc . e D NA长为392bp.古NS 3基 因表 达 质粒 p Hc VN . e DNA长为690bp.均为武汉 病 毒研 究所构建口】 .太肠杆苗 Dm n 、 E c o l i

0 6 、 表达 载体 p G EX 由武汉 病 毒研 究 所保 存.12融合基 因 衰选 载体的构 建 人工接 头台成的核苷酸为:GGAT C AG GAT C AG GATC A. 用BamH[ 和EcoRI双酵分别切下pHC Vc的Core基 因和 p HCv N的NS 3基因, 回收后 . 两基因通 过接头序列进行连接反应.插入载体pGE X 中.反应过程按文献 进行….1.3I蛆厦粒 的 讳选 和一切鉴定

1 .

3 .

1 用PCR方法 筛选质粒 . 合成pHC V c的Core基因cDNA上游引物P1和下游引物P2.台成pHC vN的NS 3基因eDNA 上游引物 和下 游 引物 P '

.用 引物 P 1和P.扩增,得到重组质粒 p HC Vc N ;

用 引物 和P2扩增,得到重组质粒 p HC VN c .

1 .

3 .

2 两 株表 达 菌株 经 小量 提取 质 粒后 . 用BamHI 、 E c o R[ 和Sac[酵切分 析.1.4衰选产物的SDS,PAGE纯化 及抗原活 性分 析 表达 质 粒在 E.

0 6中按 常规方法 诱导表达 . 苗体 蛋 白裂 解后 , 作SDS-PAGE翻备电泳 . 将翻备腔中重 收稿日期 :

1 9

9 9―0 3―0

5 , 謦回日期

1 9

9 9―0 8―1

7 作 者筒 舟:李呻东 (

1 9

6 9年一) . 男.湖北 省人, 助研.从事 病毒 分子 生物 学研究. '

通 讯作 者:粱布 雉(1947年 一) . 男,广东省 人, 研究员. 研 究方 向为病 毒 的生理 生化 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 2期 李啼东等 : 丙 型肝 炎病毒Go与NS 3基 因的 不 同融 合 方式 及其表达组蛋白条 带切下.w'

~ t t l 心管中用 P B s浸泡过夜 . 第二天12000r/'

mi n离心15r ai n . 所 得上 清 即为 古 表达 产物的粗提液 以 此粗 提液包被 于96孔 板上 , 取 自备 质控 阳性血清和 阴性 血清 进行 间接 EL I S A检测.2结果与讨论

2 .

1 重 组质粒 的酶 切鉴定 重 组质粒 p Hc V 和pHC VN c 构建 后 的结构 如图l所 示.在NS 3抗原 基因3端200bp处 有一个 S a c l 位点,将pHCVcN用BamHl 、 E

0 o RI 和Sad酶切时, 预计 得到

4950、900和

2 0

0 b D 三片段 .而pHCVN c 用BamHI 、 E c o RI 和SacI酶切时, 预计 得到

4 9

5 0 、

4 9 0和610bp三 片段 . p Hc V N 和pHc V№用BamHl 和EcoRI 双酶 切, 预计 得到

4 9

5 0和1100bp两 片段 .实际电泳 结果 与预测 完全 一致 ( 图2),说明两个 重 组质粒构 建正确 . 田1质牲pHC Vc u ~ p H CVt ~ ~ 的结构Fi g i The吐r u c n】 r e o p l * s mM p HCVc .s a a d p HCVN c

2 .

2 重组 蛋 白的诱 导表达 两株表达 菌 株在 L B培 养液 中, 培养至OD60o为0.6.每 管加IPTG至终 浓度为1mmo l / L. 再培 养5h后 , 收 集菌体 蛋白, 作SDS - P AG E 电泳 分析 .以Core基 因+NS 3基 因方 式 获得 的融合蛋 白大 小为

6 8 k D, 与预测结果一致 , 且蛋白稳 定.抗原活性较高.而 以NS 3基因+Core基因方 式获 得 的融合蛋 白大小 为66kD, 比预测 的结 果小( 图3),且蛋 白不 稳定 . 易降解 , 墨圈M维普资讯 http://www.cqvip.com 中国病毒学第15卷 田2pHC Vc n 和pHCVw c 的酵切鉴定Fi g

2 Di g e s t e d pr od u c t s o r p HCVc ~ a nd p HCVw c b y r ~ c t h ) n e t ~yme 1.

2 p HCVN c . B+ E + S 3. pHCV c n . B + E + S

4 p H CN~ c. B+ E 5. p HCVc n.B + E

6 M3 NA/ Hi n dⅢ B:B帅HI:E: Ec o RI :S: sa c 【 囤3表达产 物SDS - P AGE分析 Fi g.

3 S DS - PAGE a n a l y s i s.f p HCV a nd p H CV n c㈣ i ∞ p~ x i u c t s M :M a r k e r o f p r o t e i n mo l e c u l a r we i g h t( k D) 1.

2 Ex Dr ∞ p~ x i u c t s o f p HCVw c 3I

4 E r ∞s pr o du c t s o f p HCVc n 无法 检测抗 原活性 .这 两种基 因的不 同组合对 其编 码 的融 合蛋白空 间结构 有影响,因而影 响 了表 达产物 的理化 性 质和抗 原活性 .

2 .

3 抗原活性 分析 将pHC Vc ~ 表 达物 以1:50稀释 后包被

9 6孔板 , 用EL I S A方法检 测 自备 质控血 清中的10份阳性血清 、

1 O份 阴性血清 . 同时用上海 实业科华 公司 的抗. HC V 抗体 EL I S A 检测 试 剂盒 作参照,检测结果 见表 l ( 质粒 p HC V~ c 表 达抗 原有降解 , 未 检测活性 ) .p HC Vc 表达 抗 原的粗 提物.已能 明显地 检测出阳性 血清和 阴性血 清.用 科华 抗HC V 第三代 试 剂平 行检 测,检出情 况一致.但 效果 比科华 产品差 , 同一阳性 血清, 科华测 出数值较 高;

而同一 阴性血 清,科华测 出的 数 值较低 .考 虑到科 华试剂 盒中包被 抗原有 C o r e 、 N S

3 、 NS

4 、 N S 5等 区域 , 而 本表 达抗原仅 有Core和NS 3融合 蛋白, 且未 经高度纯 化 .在检 测后 能 有这 样 的结 果,显示融合 抗原具有 良好 的应 用前 景 .作为 一种单 一的抗原 , 其表 达产物 的纯化 和后续 的包被 , 较 多抗 原组 分 的分散 表达,包被和 纯化要 方便和 简单得 多 .以 C o r e +N S 3为基 础,继续融合其它抗 原基因片段 有可能进 一步提 高抗. HC V的诊 断水平 . 衰1HCV阳性 血清 和 阴性血 ;

膏E L ~ S A 检测 结果Ta b l e l ELI S A de t e c t i o n o f H CV F o s i t l ve㈣ a nd n~ t l r e E t e F o m 参考文献【1】毕胜 利, 白宪鹤 . 丛勉尔.等.中国 人丙 型肝 炎病 毒基 因组 的 一级 结 构及 其变 异[J】.病毒 学报 .

1 9

9 3 .

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2 】 Tr o wb r l d g e R,Go wa n s E J Mo l e c u l a r c l o r ~ n g o f n Au s ~ r s l i a n i s o l a t e o f h e p a t i t i s C v i r u s[ J 】 Ar c h Vk o

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1 [

3 】 李唪 末,檗布 锋, 祁 白柏 丙型 肝 毙病 毒北 京株 N S 3基 因的 克隆 及涮 序[J】生命 科学 研兜.1999.3(1):53--5

7 f

4 ] 萨姆 布鲁 克.弗里 奇,曼尼阿 蒂斯 著.金冬 雁等 译.分子 克隆 实 验指 南[M】 . 第 二版 . 北京:科学出版 社.1992维普资讯 http://www.cqvip.com 第 2期 李哺东等:丙型肝 炎 病毒 C o l e与NS 3基 因的 不 同融 合 方式 及其表达

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7 Fus i o n Ex pr e s s i o n o f He pa t i t i s C Vi r u s Co r e Re gi o n a nd NS

3 Re g i o n i n E . c o l i LI W e i ― d

0 n g ,LI ANG Bu - f e n g ,QI Z i - b a i ( 肌 I n s t i t u t e V i r o l o g y.Ac a d e mi a S i n i c a.Wu t mn

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7 1 .C h i n a ) ( Na t ~, ml I n s t i t u t e 妇ConcrolPharma c e n t i c a l a n dB i a l o g ~ c a l P r o d u c t s .B e C j i n g

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5 0 ,C h i n a ) Ab s t r a c t :Th e g e n e e n c o d i n g t h e c o r e a n d NS3 p r o t e i n s o f h e p........