PDF《产品简介》

产品简介 产品组成 保存条件 实验流程 应用实例 常见问题与解决方案

1 产品简介 GenRec Assembly Master Mix Kit 是一款简单、快速、高效的多片段 DNA 定向克隆产品,本试剂盒可以将 PCR 产物定 向克隆至任意载体的任意位点.

做法是:将载体在克隆位点进行线性化,并在插入片段 PCR 引物 5'

端引入线性化克隆载体末端 序列,使得插入片段 PCR 产物 5'

和3'

最末端分别带有和线性化克隆载体两末端对应的完全一致的序列(20 bp~40 bp).将这 种两端带有载体末端序列的 PCR 产物和线性化克隆载体按一定比例混合,在重组酶的催化下,仅需反应 15-60 min 即可进行转 化,完成定向克隆.克隆阳性率可达 90%以上. 试剂盒中 2*GenRec Assembly Master Mix 预混了重组酶和重组反应所需缓冲液,并添加了特殊成分,可显著提高重组克 隆效率,可以一次实现多至 3-6 个片段的顺序拼接克隆. 产品特点 ? 简单,快速 ? 无需考虑酶切位点,任何片段可克隆到任何目的载体的任何位置 ? 克隆阳性率在 90%以上,降低克隆筛选的工作量 ? 插入基因片段不带无关序列,真正的无缝克隆 ? 可同时进行最多

6 个DNA 片段的组装 应用范围 ? 快速定向克隆 ? 无缝克隆 ? 多片段插入和连接 ? 快速定点突变,可同时实现多个位点的定点突变

2 产品组成 2*GenRec Assembly Master Mix Positive control(四个 PCR 片段,一个线性化载体) PET-SEQF/SEQR(菌落 PCR 用引物) CL08010 CL08020 CL08050 2*GenRec Assembly Master Mix 100ul 200ul 500ul 阳性对照片段 8ul 8ul 8ul 阳性对照载体 2ul 2ul 2ul 载体引物 20ul 20ul 20ul

3 保存条件 -20℃避光保存

12 个月,避免反复冻融

4 实验流程 4.1 单片段重组流程概览 图一:使用 2*GenRec Assembly Master Mix 将一个基因片段克隆到目标载体,实验需要基因片段和线性化载体.该线性化载 体可以通过限制性内切酶酶切载体获得, 或者用反向 PCR 扩增环状载体获得. 插入片段由 PCR 扩增获得, 所用的两条引物在 5'

端添加线性化克隆载体末端序列(图中用绿色和橙色标记) ,这样获得的 PCR 产物 5'

末端和 3'

末端的序列和线性化载体末端 的序列完全一致. 4.2 多片段重组流程概览 图二,使用 2*GenRec Assembly Master Mix 将四个基因片段克隆到目标载体. 该线性化载体可以通过限制性内切酶酶切载体获得,或者用反向 PCR 扩增环状载体获得.插入片段由 PCR 扩增获得,所用 的两条引物在 5'

端添加同源序列(图中用多种颜色标记) ,最终使得多个片段能够按照设定的顺序组装进同一载体.例如 A 片 段左边红色序列为和载体同源的序列,右端绿色序列为和 B 同源的序列.五种不同颜色的同源序列之间互不相同以确保片段按照 既定顺序连接,避免产生错误连接. 4.3 制备线性化载体 重组酶只能利用线性化的载体,因此线性化是克隆成功的前提.获得线性化载体可以通过限制性内切酶酶切或 PCR 反向扩 增. 4.3.1 限制性酶切方法 选择合适的克隆位点,并对克隆载体进行线性化.尽可能选择双酶切(而不是单酶切)以减少背景菌落.酶切后通过胶回 收的方法纯化 DNA,这样能避免载体两酶之间的片段 DNA 对后续重组实验的干扰. 酶切反应的体系,使用 NEB 的限制性内切酶酶切. 反应组分 用量 DNA 2-5ug Cutsmart 5ul Enzyme1 5U Enzyme1 5U ddH2O To 40ul ? 酶切 2-3 小时. ? 琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物,配制 0.7%的琼脂糖凝胶,以5V/cm 的电压电泳 40min,用琼脂糖凝胶纯化试剂盒纯 化线性化的载体 DNA.用30ul 洗脱液洗脱. ? 检测载体线性化程度:将10ng 线性化的载体 DNA 转化感受态细胞(效价 1*108 cfu/ug) , .如果次日平板上的克隆 多于

50 个,说明载体线性化不够完全,需要减少质粒用量或增加限制性内切酶量,重新酶切载体. 4.3.2 反向 PCR 方法 制备线性化载体 DNA 的引物设计如下图所示: PCR 制备线性化载体的关键在于保证 PCR 扩增的保真性和特异性,通常载体序列长达 3kb-8kb 不等,建议使用 Generalbiol 的2*GPV8 HF Master Mix,8kb 的基因片段扩增并不容易,2*GPV8 HF Master Mix 能够稳定实现 8kb 的基因片段的成功扩增. 扩增的模板最好使用已经酶切线性化后的载体 DNA, 而不用环状质粒, 这样可以减少残留的模板质粒对后续克隆造成 的高背景,低阳性率的可能.因为即使是残留 0.1ng 的质粒,使用正常的感受态细胞也能在平板上长 102-103 个克隆.如 果必须使用环状质粒 DNA 作为 PCR 模板,需要在 PCR 结束后用 DpnI 消化甲基化的质粒模板,加1ul 的DpnI 限制性内 切酶

37 度消化

1 小时,然后再胶回收或柱回收纯化 DNA. 注意:如果 PCR 制备线性化载体时,有非特异性条带的出现,一定要切下目的载体的条带,进行胶回收纯化,才可进 行后续实验. 4.4 插入片段的扩增 4.4.1 通过引物设计加入同源序列 重组依赖于克隆载体与插入片段,以及相邻插入片段之间的同源序列(20-80bp) ,通常克隆的基因两端并没有和载体 相同的同源序列,需要 PCR 获得有同源序列的基因片段,这是通过引物设计和高保真的 PCR 反应来实现. 如图一所示,通过设计引物,使正反向引物的 5'

端分别带有载体两末端 20-40bp 相同的序列,而引物的 3'

端为和 目标基因特异性结合的序列,该区域长度需达到 17-25bp,这样总引物长度为 37-65bp,使用该对引物 PCR 扩增目标基 因就可以获得带有同源序列的目标基因. 在设计引物时请遵循以下原则:

1、 正、反向引物的 5'

端的同源序列和线性化载体两末端序列完全一致.如果使用酶切法制备线性化载体,同源序 列包括酶切位点及其临近的核苷酸序列.

2、 正、反向引物的 3'

端是特异性扩增目的基因必需的,因此要依据 3'

端这一段序列计算引物的退火温度,而不 是根据引物全长计算.为保证 PCR 反应的顺利进行,引物的退火温度应选在 55-65℃之间,两对引物之间的 GC 含量 和退火温度应尽可能接近,Tm 值相差要小于 5℃,可以通过改变引物结合位置或调整引物长度实现.

3、 同源序列的设计非常有必要,尤其是做多个片段组装时,尤其要谨慎设计同源序列,避免同源序列为重复序列, 和其他序列重复,或本身具复杂的二级结构,假设同源序列本身形成发卡结构,该片段与下一个片段连接的效率大大 降低,导致重组的失败.多个同源序列之间也要不同,如果多个同源序列之间出现 10bp 以上的相同序列,会导致错 误重组的发生,最终产生个别片段的缺失. 4.4.2 插入片段的 PCR 扩增

1、 减少模板量 为了保证克隆反应的高阳性率,减少后期克隆筛选的工作量,在PCR 扩增基因片段时,应使用尽可能少的 DNA 模板, 对于质粒 DNA 模板 1-20ng 即可.如果使用 cDNA 为模板,加入量则取决于目的基因的表达量,

2、 PCR 产物扩增和纯化 如果 PCR 扩增存在难度,可以使用通用生物的 2*GPV8 Master Mix(Cat.No.PE06)完成复杂模板的扩增. PCR 反应结束后,应用琼脂糖凝胶电泳确定 PCR 反应成功,如果扩增得到一条清晰、干净的条带,且插入片段小于 4kb,那么只需应用纯化柱回收,以去除 PCR 反应中剩余的酶、反应缓冲液. 如果 PCR 扩增的结果有非特异性扩增条带,则需要凝胶回收纯化分子量正确的片段,以去除剩余非特异性扩增片段对 后续实验的干扰. 2*GenRec Master Mix 对于体系中盐离子的耐受性较高,因此 PCR 反应结束的产物也可以直接用来做重组反应,只 要先通过电泳检测 PCR 成功扩增了目的基因, 而且无非特异性条带, 尤其是扩增片段相对较小时 (小于 1.5k) . 直接用 PCR 产物做重组的优点是能够省去回收纯化的时间,缺点是,但是这样获得的产物保存时间不够长,在有核酸酶污染的情况下 可能次日就会被降解,同时直接使用 PCR 产物做重组会一定程度上降低重组效率.当您需要直接使用 PCR 产物做重组时, 建议 PCR 产物添加量不超过反应体系的 1/5,即不超过 4ul. 4.4 反应的设置 本试剂盒中包含了 Positive control 样品,可以帮助用火在实验室测试该方法,并对产品进行检测.Positive control 包含 了一个 2.6kb 的线性载体 DNA 和4个插入片段,分别长 1000bp、1000bp、1000bp、720bp.

1、按照下表在冰上设置重组反应: 反应组分 用量 Positive control 插入片段 20-200ng 2ul 线性化载体 50-200ng 1ul 2*GenRec Assembly Master Mix 10ul 10ul ddH2O To 20ul 7ul GenRec Assembly Master Mix 重组反应体系, 最适载体使用量为每线性化片段 0.03pmol, 片段和载体摩尔比为 1:1-3:1. 该摩尔数对应的 DNA 质量可由以下公式计算获得: 载体添加量(ng)= 0.02*片段碱基对数(bp) (对应的片段量为 0.03 pmol) 例如一个 5kb 长的载体 DNA,其最佳使用量为 100ng,插入片段的加入量由以下公式计算: 片段添加量(ng)= 0.06*片段碱基对数(bp) (对应的片段量为 0.09 pmol)

2、充分混匀各组分,使用枪头轻柔吸打或旋转,避免产生气泡(请勿剧烈震荡或涡旋混匀,大片段 DNA 容易受剪切力影响) . 然后置于 50℃反应 15-60 分钟. 推荐在 PCR 仪或水浴锅等温度控制比较精确的仪器上反应,单片段重组反应 15-30 分钟即可,在30 分钟重组效率达到最 高.多片段重组(3-5 个片段)需要更长的重组时间以达到最高的效率,通常为 40-60 分钟. 实验验证,重组的反应温度在 48℃-55℃均可,重组效率上会有微小的差别,推荐使用 50℃. 4.5 反应产物转化、涂板 (1)取100ul 化学转化感受态细胞于冰上解冻. (2) 取上述反应液

10 μL (不超过感受态细胞的 1/10, 否则会降低转化效率) 加入到感受态细胞中充分混匀. 冰浴 10min. (3)将离心管置于 42℃水浴锅中热激 90s,然后迅速放回冰上,使细胞冷却 2~3min. (4)向离心管中加入已预热的无菌 LB(或SOC)培养液 600μL,37℃恒温振荡培养 45~60min. (5)短暂离心弃上清,吸取

100 μL 的新鲜 LB 培养基重新悬浮,将菌液均匀涂布在含有适当抗生素的平板上.待培养基 充分吸收菌液后,将平板倒置,于37℃过夜培养. 4.6 克隆鉴定 菌落 PCR 用无菌的枪头或牙签将单个菌落挑至 20~50μL LB 培养基中混匀,直接取 1μL 作为 PCR 模板,使用 2*Taq DNA Master Mix 进行菌落 PCR 实验. 质粒酶切验证 用枪头挑取细菌少许加入含有相应抗生素的 4ml LB 培养液中置于 37℃过夜, 次日进行质粒 DNA 小量提取, 然后用限制性 酶切的方法判断所选菌落是否为阳性.

5、应用实例 实例一 实验目的,在PUC19 克隆载体的 EcoRI 和HindIII 酶切位点之间加入 EGFP 表达基因 载体克隆 MCS 区域如下: 最终构建样式如下 ? 用EcoRI 和HindIII 双酶切 PUC19 质粒获得线性化载体 ? 插入片段 PCR 的扩增引物设计 插入片段 ........