PDF《丝壁型 型》

/ 专1994年3月中国病毒学ⅥR0m G CA SI NI CA No+1 l

99 4 生物素标记 G F V - e D N A探针的制备及 在检测葡萄扇叶病毒上的应用 谷洪仓'

严敦余 刘焕庭 ( 山东农业大学 , 睾安

2 7

1 0

0 r ) 邱并生 I , 王晋芳 田波一(中国科学院徽生物研究所, 北京

1 0

0 0

8 0 ) 一.

, 年| 提要以整 合到 质粒 中的 GF V - c D NA为模板 经PCR合 成 了生物 索标 记的 G F V单、双链探针 . 用合成的探 针对 提纯 的GFV-RNAz 、 感染 GF V的昆诺藜 叶及

1 8株葡 萄进行 DN A - R I q A杂 交检测 表明一检测提纯病毒 R N A : 的灵敏度为

1 +

5 p g / 斑点 , 感染 G F V的昆诺藜提取液最高稀释度可遮

4 0

9 6

0 倍III株显示典型扇叶症状的样品杂交结果均为阳性 , 且汁液稀释

4 0

0 ~8

0 0 倍仍能澳 I 出,?株不显 示典型扇叶症状的葡萄中

3 株受到 G F V的侵染.单、双链探针最适使用浓度分别为

1 /

2 0

0 及l/100关键词堕皇!丝壁型型型, P c R 技术,核酸斑点杂交必晴, 葡萄扇 叶病 在世界各地均有 发生 , 是葡萄 上最为普遍和 严重 的一种病毒病 窖,罹病 葡萄 可减产

2 0 ~8

0 [ I ] . 近年来 , 许多 国家都开展 了葡 萄脱毒苗的培育和 推广 , 同时进行 了葡萄扇 叶病毒( G r a p e v i n e F a n l e a f V i r u s , G F V) 检测技术的研究 . 国内、 外曾报道 用ELISA[ . ] 及 P标记 的探针检测 O F V t .这些方 法在应用上均 存在一些 问题 , 前 曹灵敏度稍低 , 后 者对环 境有一 定 污染等.最近几 年,生物索标记核酸探针检测植物病 毒及类病毒的研究I s , s : 引起 了国 内外广泛 重视 .生物 紊标记核酸探针最常用方 法为缺 口翻译法 , 仅就汝 【 =

1 翻译本身而言 , 就需 三种不同 的操作 .聚合酶链式反应( P o l y me r a s e C h a i r R e a e d o n , P C R) 技术 只需一步操作 即可合成核 酸探 针,且生物紊掺入量较高哪. 我 们根据 G F V已知的核酸 序列利 用PCR技术合 成了生物 紊标记 的GFV・eDNA单 、 双 链探针 , 并采 用 核酸斑 点 杂交法 , 分别 检测了提纯 的GFV・RNAz,感染GFV的昆诺藜及葡 萄样 品,并同时对单 、 双链探针检测结果作了 比较 .现 将结果报道如下 t 材 料和方 法1GFV-POqAt的提取及引物的合成

1 .

1 病毒的提纯 G F V毒源由中国农科院果树研究所刘福昌先生提供 .繁殖于昆诺藜 ( c l ) 上,接种

1 5 天后采收 , 病毒的粗提纯基本参照 P i n k 等[ a

3 的方法.{ l 【 提纯病毒的进一步提纯参照 Q u a e q u a r e t U 车文于

1 9

9 2 年 8月

1 4日收到 ,

1 9

9 3 年 9月

1 0日修回 ・现在工作单垃 : 山东省果树研究所. 地址 : 睾安市龙潭略

6 4学, …

5 编271000维普资讯 http://www.cqvip.com 一第1期谷洪仓荨 ,生物素标记 G F V ― c DH A探针的制备及在检测葡萄扇叶病毒上的应用 d

9 等.的方法.精提纯的 M带病毒用于 G F V - R N A : 的提取. I .

2 GF V - R N Az 的提取 方 法参 照文自 ] , 提取的GFV-RNA ~ 用作 e D N A合成 的母本链 . I .

3 弓f物的合成 参照 S e r g h i n i 报道㈨ 的~FV-RNA2序列设计

5 , 及3,端引物.5 , 端 引物 ( 引物

1 ) 的序列为 '

r G AG A GGA

3 ,

3 端 引物 ( 引物

2 ) 序列 为TTAAA GT C A GA T A C C CI '

GG A C3 ~ .引物 经 中国科学院 镦 生物 所技 术室 D N A合 成仪合成 .

2 G F V - c D N A的合成及克隆 &

l G F V - c D N A合成 q nL R N A z 经热变性后 , 按试剂盒说明 , 用上述合成的弓 f 物台成 e D N A.

2 .

2 克隆 采用 S a mb r o o k 等 方法 , 以pB1ucscripth为载体 经SrnaI 酶 切成千未 端,转化且X/

2 - Ba s , 转化物涂于含

5 0 ~ s / m l A m p 及X-gal和IPrG培养基上,

3 7 '

(

2 培养过夜 , 挑选白色克隆. 将选 出的克隆扩大培养 , 抽 提质粒 , 用限制性 内切酶酶解后电泳分析. , 核酸探针的制备 I 探针的制备 参照 F a n a m m l 的方法口 司,取上述抽提质粒 , 加TE(pH8.O)适量溶解 . 取5用作 P C R扩增 的母 本链 . 加人

1 0 *扩增缓冲液

1 0

1 .

2 n m~ o l / L d N T P吼,Bio-11-dDTP

5 , D N A高温聚合酶1.25,5

0 p m o l / L引物

1 及引物

2 各1(合成双链探针 用量) 或加人

1 弓l物1及0.01的引物

2 ( 合成单链探针用 量),加Hz O使 总体 积迭

1 0

0 后置PcR扩增 仪扩增 , 合 成探引强 电泳分 析后 , 检测生物 索掺 人量 .

3 .

2 台成探针 的 检测 参照BRL公司 '

核 酸斑 点杂交

4 .

1 样品制备 将昆诺藜或葡萄叶片约

0 .

2 g 液氮研磨成粉末状 . 加m55|I1lRNA提取液 (

0 .

2 n 叫/ L I r i s ・ H a p H

9 .

0 , m

4 m o l / L ,

2 5 m m o l / LE l Y r A,

1 s D s ) 淀匀. 加等体秘酚混匀 ,

1 2

0 0

0 r / m离心

2 分钟 , 取上清 液再次用酚抽提 , 上清液加等体积氯仿混匀后

1 2

0 0

0 r / m离C-2分钟 , 上清液再用酚抽提 , 所得上清加等体积 氯仿混匀后

1 2

0 0

0 r i m离心

5 分钟 . 取上 清赦

5 叭/L加

3 m o l / L乙酸钠 ( p H S .

0 ) 及2.5倍体积的无水 乙醇 ,

4 '

C 下放置半小时 .

1 2

0 0

0 r / m离心

5 分钟 , 沉淀加 o .

3 | I

1 l

2 t o o l / L I ~ C l _ 悬浮, 再加3

0 u l / L乙酸钠及 互5 倍体积 无术乙醇 ,

4 ℃下放置

3 0 分钟 , 离心弃上清 , 沉淀用二乙基焦碳酸醑( D E P C ) 处理的蒸馏承

5 悬浮. 一7

0 ℃保存备用 .G F V - R NA ~ 的提 取方法 为t1

0 精提纯 M 带病 毒加等 体积酚 混匀后

1 0

0 0

0 r / m 离心 1分钟 , 上清 加 等体积酚一 氯仿(

1 :

1 ) 混匀 . 然后再次离心, 上清加

2 .

5 倍休j } f 的乙酵及

5 叫3mol/L乙酸钠 ,

4 0 '

C 放置

3 0 分 钟后离 心,沉淀用 D E P C处 理蒸 馏术

5 悬浮.G F V - R NA ~舍量测 定参 照文献 r

1 . 】 . 样 品在斑 点杂交 前先 经变性 处理 , 处理 方法采 用 甲醛变 性{ 击.

4 2 斑点杂交 将硝酸纤维索膜( N C膜.北京化工学校附属工厂生产 , 孔径 o .

4 5 岬)在无菌水中浸透 , 再经 i

0 *s s c浸泡 I

5 分钟 , 取出晾干 , 每十样品点样

1 , 然后将 N C膜置

8 0 ℃干操

2 小时. 斑点杂变的方法参 照文献[ 报道 , 检测葡萄样品时 , 阳性对照用提纯的 G F '

4 - P

2 ~ A t I-

1 0

0 稀释液 , 阴性对 照用实 生葡 萄叶片提 取液 . 结果与分析

1 e D N A的合成与克隆 以GFV―RNA2为模板 经逆转录 合成 了GFV外壳 蛋白基 因的 e D N A, 然后 再 以合 成的 e D N A为模板进行 P C R扩增 , 扩增 样品经凝胶 电泳分 析表 明,合成了长度为 I .

5 k b的GF V外壳 蛋白基 因 .合成 的基 因经与酶 切后 的质粒进行钝端连接后 , 被成功地转 入到 c o / / 细胞 中,见图l.2探针中生 物素 掺人量 的测定 结果 以重组质粒 中病 毒外 壳蛋白基因 e D N A为模板合成了长度为

1 .

5 k b 生物 索标记 的单 、 双 链探针 .合成的探 针 经不 同 梯度 稀 释后 检 测表 明,双链探 针经20000倍 稀释 、 单链探针 经 维普资讯 http://www.cqvip.com

5 0 中国病毒学第9卷10000倍稀释后 仍有 信号 出现 , 这证 明生物索一

1 I - d UT P经PcR大量掺入到单 、 双链探针 , 见图 2. 田1OFV-(Z~基因的酵切田田谱分析. 重组质粒的琼脂禧磋殷 电泳 l b . O F V = C ~基因爵切图谱.

1 、 标准分子t( +B ∞ R

1 ) l

2 . B ^ 嘣【单酵切 l 酗r n H【 +s a l 双酵切 l

4 . B o o R

1 +S a d 双爵 切}

5、pBh_-1^IⅢI 蛐of幢蜘l岫啡ma p o f of a F a ~e a fV i r ~. ^ 擘嘴gdd 蜘叩h c B f e n 删阻趣l m h T 删岫鲫em a p ,

1 . M出Mw<

s p 皿+ E o o m ) l已衄l删胃nh晰 m } d i g 蹲叫 啦B日栅&

SadlIcB田wi t hR删&

Sadl 矗p啦- 州一胛5图2单链 ( ^ ) 双链c B ) 探针中生锄素-

1 i - d U T P播凡t 测定结果 . 从左到右稀 释度为 l,1

0 ,1,1

0 0 ,l,1

0 0

0 , l,

1 0

0 0

0 . 1-

2 0

0 0

0 阴性对照 F i

2 Dc I 自∞of0tiI卜i

1 - d UTP i n b h n ― bb e l l S S ( ^)d s ( B ) - ~ b e I ) ~ ~ o n ( f r o m t o岫I)1_】 0,1-1

0 0 .1-

1 0

0 0 .1-i

0 0

0 0 .1―

2 0

0 0

0 . C K( n ~ ∞ o I )

3 斑 点杂 交结果

3 .

1 探针浓度对杂交灵敏的影响 单链 探针

8 0

0 倍稀释时杂交 信号较弱 , 随探针浓度的增加信号逐渐增 强,但稀释小于

2 0

0 倍时杂交信号变化不 明显 双链探针

8 0

0 倍稀释时 , 信号极 弱,随探针浓度增 加,杂交信号逐渐 增强,但与

5 0 倍与

1 0 0倍稀 释的探针杂交 结果接近 .结 果还 表明100倍稀释 的双链探 针与

2 0

0 倍稀释的单链探针杂交结果相近 , 可作为探针检 测甩的工作浓度 , 见图

3 .

3 .

2 灵敏度 与特异性测定结果 提纯 的GFV― R NA , 健 康及感染 G F V的昆诺藜提取液 经不 同梯度稀释后检 测表 明,斑点杂交 可检测 G F V ― R N A . 的最低量 为1.5pg/斑点.可检测昆 诺藜病 叶提 取液最大 稀 释倍数为 汀II队维普资讯 http://www.cqvip.com 第1期答洪仓辞 ・生物素标记 G F V - e DN A探针的翻备殛在检测葡萄扇叶病毒上的应用

5 l

4 0

9 6

0 倍,健康对 照无杂交信号 出现 , 见图3.3.3葡萄样 品的检测 l 8株不 同品种 的葡 萄样 品经1/lo,1/5o,1/1O0.1/2oo,1/4oo,1/8oo6个 不 同梯度稀 释后,分别用单链探针 (

1 /

2 0

0 ) 及双链探 针(1/10........