PDF《产品说明书》

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2 US EVERBRIGHT? INC.

技术支持: 0512-88965152 www.useverbright.com 产品说明书产品名称:FITC-Annexin V 和PI 细胞凋亡检测试剂盒 产品货号:F6012 产品规格:50T,100T 产品内容: 组分 50T 100T A.5* Annexin V 结合缓冲液

5 mL

10 mL B.FITC -Annexin V

250 μL

500 μL C. PI

10 μL

20 μL 储存条件 4℃避光冷藏,请勿冻存.本产品在推荐条件下至少可 以储存

6 个月. 光谱特性 FITC-Annexin V: Abs/Em = 494/518 nm PI: Abs/Em = 535/617 nm (with DNA) 产品介绍 FITC-Annexin V 和PI 凋亡试剂盒提供了一种快速 简便的方法, 通过标记早期凋亡细胞 (绿色) 和坏死细胞 (红色),用于检测细胞凋亡水平.产品可以使用流式细胞仪或 其它荧光检测设备进行检测. FITC-Annexin V 可以标记凋亡细胞.Annexin V 选 择性结合磷酯酰丝氨酸(phosphatidylserine,简称 PS).在 细胞发生早期凋亡时,PS 会外翻到细胞表面,即细胞膜 外侧.用绿色荧光探针 FITC 标记的 Annexin V,即FITC-Annexin V,可以结合外翻的磷酯酰丝氨酸,从而检测 细胞凋亡的重要特征. 碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)是一种 DNA 结合染 料, 它可以染色坏死细胞或凋亡晚期丧失细胞膜完整性的细 胞的细胞核.PI 可以由 488,532 或546 nm 的激光激发, 呈现红色荧光. 使用方法 下列实验方案以利用星形孢菌素诱导 Jurkat 细胞凋 亡为例, 如果使用其他诱导剂和其他类型的细胞,实验条 件需要略作调整.

一、流式细胞检测 1. 根据实验要求诱导细胞凋亡.检测样品中应包含未经处 理的细胞样品, 作为阴性对照. 此外, 设定一组样品做单染, 用于调节补偿. 2. 收集细胞. 悬浮细胞:

300 g, 4℃离心

5 min 收集细胞;

贴壁细胞:用不含 EDTA 的胰酶消化后

300 g,4℃离心

5 min收集细胞,胰酶消化时间不宜过长,以防引起假阳性. 3. 用蒸馏水按 4:1 的比例稀释 5* Annexin V 结合缓冲液, 如配制

5 mL 的1* 结合缓冲液,则在

1 mL 5* Annexin V 结合缓冲液中加入

4 mL 蒸馏水. 4. 用1*结合缓冲液按 9:1 的比例稀释 PI, 配制 PI 工作 液.如配制

10 mL 的PI 工作液,则在

1 mL PI 中加入

9 mL 1*结合缓冲液. 5. 用预冷的PBS 洗涤细胞两次,每次均在

300 g,4℃下离 心5min,收集 1-5*

105 个细胞并用100 μL 1* 结合缓冲液 重悬细胞. 6. 每管加入 4-5 μL 的FITC-Annexin V 和1-2 μL 的PI

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2 US EVERBRIGHT? INC. 技术支持: 0512-88965152 www.useverbright.com 工作液. 注:我们推荐准备两管额外的流式管, 每管只加入一种单染 染料 (FITC-Annexin V 和PI) , 用于流式单染的补偿调节. 7. 室温避光孵育 10-15 min,为避免细胞凋亡进程,孵育 过程可在冰上操作. 8. 每管加入

400 μL 的PBS 或1* 结合缓冲液,尽快通过 流式细胞仪检测细胞凋亡情况.FITC-Annexin V 可以由 488nm 激光激发, 检测荧光发射光谱约在

530 nm 处(FITC 通道),PI 通道发射光谱约在

617 nm 处(注:PBS 或1*结合缓冲液的选择根据不同凋亡处理以及不同细胞具体 选择).

二、荧光显微镜检测 对于悬浮细胞,可参照流式细胞检测的方法进行具体操作. 1. 在盖玻片或载玻片小室中接种细胞. 2. 根据实验要求诱导细胞凋亡.检测样品中应包含未经处 理的细胞样品,作为阴性对照. 3. 用PBS 洗涤细胞. 注:细胞收集后如果不用 PBS 清洗,可以用含血清的培 养基直接替代Annexin V 结合缓冲液,但是 Annexin V 的 使用浓度需要重新优化. 4. 用蒸馏水按 4:1 的比例稀释 5* Annexin V 结合缓冲液. 如配制

5 mL 的1* 结合缓冲液,则在

1 mL 5* Annexin V 结合缓冲液中加入

4 mL 蒸馏水. 5. 用1*结合缓冲液按

9 :1 的比例稀释 PI, 配制 PI 工作 液.如配制

10 mL 的PI 工作液, 则在

1 mL PI 中加入

9 mL 1*结合缓冲液. 6. 每100 μL 的Annexin V 结合缓冲液中加入 5-25 μL 的FITC-Annexin V 和1-2 μL 的PI. 注:最佳使用浓度由具体实验要求确定. 7. 向培养板中加入足量的染液以覆盖全部细胞,室温避光 孵育 15-30 min. 为避免细胞凋亡进程, 孵育过程可在冰上操 作,但孵育时间至少延长至

30 min. 8. 用1* 结合缓冲液清洗细胞. 9. 将孵育有细胞的盖玻片置于载玻片上,载玻片可提前加 一滴 1* 结合缓冲液;

对于培养在小室内的细胞,可直接加 入足量的 1* 结合缓冲液覆盖细胞. 10. 使用合适的滤光片在荧光显微镜下观察细胞. FITC-Annexin V 可用 FITC 适用的滤光片,PI 可用 Cy3 或者 Texas. 相关产品 货号 产品名称 C4069-5mg 6-CDCFDA SE C4070-5mg 5(6)-CFDA, SE S1005-100 μL SuperViewTM

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