PDF《Glutathione Beads》

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4 常州天地人和生物科技有限公司 Glutathione Beads 目录 1.

产品介绍…1 2. 纯化流程…1 3. 填料清洗…2 4. 问题及解决方案…2 5. 订购信息及相关产品…4 1. 产品介绍 Glutathione Beads 可以一步纯化各种表达系统表达的谷胱甘肽-S-转移酶、 谷胱甘肽依赖 性蛋白和谷胱甘肽转移酶的重组衍生物.Glutathione Beads 是以 4%琼脂糖凝胶为基质, 通过

12 个原子的间隔臂,用化学方法共价结合了还原型谷胱甘肽制作而成.这种特别设计 使树脂的纯化效率得到了提高,因此树脂载量大于 20mg GST 融合蛋白.Glutathione Beads 具有载量高、特异性好、性价比高的特点. 表1. Glutathione Beads 产品性能 项目 性能 基质 4%琼脂糖凝胶 配体 通过

12 原子间隔臂偶联的谷胱甘肽 载量(/ml 基质) >20 mg GST 蛋白(40 kDa) 微球粒径(μm) 45C165 最大压力 0.1 MPa,

1 bar pH 稳定范围 3-12 储存缓冲液 含20%乙醇的 1XPBS 储存温度 2°C-8°C 2. 纯化流程 2.1 Buffer 的准备 所用水和 Buffer 在使用之前建议用 0.22μm 或0.45 μm 滤膜过滤. 结合/ 洗杂液: PBS, pH 7.4 (140 mM NaCl, 2.7 mM KCl,

10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4) 洗脱液:

50 mM Tris-HCl,

10 mM 还原型谷胱甘肽, pH 8.0 注意: 结合液和洗脱液中可加入 1C10 mM DTT. 2.2 样品准备 样品在上样前建议离心或用 0.22μm 或0.45μm 滤膜过滤,减少杂质,提高蛋白纯化效率 和防止堵塞柱子.

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4 常州天地人和生物科技有限公司 2.3 样品纯化 1) 将Glutathione Beads 装入合适的层析柱,用5倍柱体积的结合液进行平衡,使填料 处于与目的蛋白相同的缓冲体系下,起到保护蛋白的作用. 2) 将样品加到平衡好的 Glutathione Beads 中, 保证目的蛋白与 Glutathione Beads 充 分接触,提高目的蛋白的回收率,收集流出液. 3) 用10-15 倍柱体积的洗杂液进行清洗,去除非特异性吸附的杂蛋白,收集洗杂液. 4) 使用 5-10 倍柱体积的洗脱液,收集洗脱液,即目的蛋白组分. 5) 依次使用

3 倍柱体积的结合液和

5 倍柱体积的去离子水平衡填料,最后再用

5 倍柱体积 的20%的乙醇平衡,然后保存在等体积的 20%的乙醇中,置于

4 度保存,防止填料被细菌 污染. 2.4 纯度检测 将使用纯化产品得到的样品(包括流出组分、洗杂组分和洗脱组分)以及原始样品使用 SDS-PAGE 检测纯化效果. 3. 填料清洗 GST 标签蛋白纯化产品可以重复使用而无需再生,但随着非特异性结合的蛋白的增多和蛋 白的聚集,往往造成流速和结合载量性能下降,这时需要对树脂进行清洗. 去除一些沉淀或变性物质,建议使用下面的方法 用2倍柱体积的 6M 盐酸胍溶液进行清洗,然后立即用

5 倍柱体积的 PBS, pH 7.4 清洗. 去除一些疏水性吸附造成的非特异性吸附物质 用3-4 倍柱体积的 70%乙醇或

2 倍柱体积的 1% Triton? X-100 清洗, 然后立即用

5 倍柱 体积的 PBS, pH 7.4 清洗. 4. 问题及解决方案 问题 原因分析 推荐解决方案 柱子反压过高 填料被堵塞 按照第3部分进行树脂清洗. 裂解液中含有微小的固体颗粒,建议上柱前 使用滤膜 (0.22μm或0.45μm) 过滤,或者 离心去除. 样品太粘稠 样品中含有高浓度的核酸,加长破碎时间直 至粘度降低,或者添加DNase I (终浓度5 μg/ml),Mg2+(终浓度

1 mM),冰上 孵育10-15分钟. 缓冲液太粘稠 有机溶剂或者蛋白稳定试剂(如甘油等)可 能会引起反压增高,降低操作流速. 洗脱组分中没有 目的蛋白 GST标签蛋白变性了 使用温和的裂解条件,实验条件以经验为 准. 过度的裂解使目的蛋白变 性 目的蛋白聚集产生了沉淀 在细胞裂解前溶液中加入DTT,终浓度为 1C20 mM.

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4 常州天地人和生物科技有限公司 融合蛋白改变了GST的构 象,影响了目的蛋白的结 合力 测定pGEX 中GST的结合力,对载体进行超 声处理,检测其结合力.如果载体中GST有 很高的亲和力,有可能改变融合蛋白的构象 从而降低了GST标签蛋白的亲和力. 降低结合温度至+4°C,充分地清洗. 柱子平衡时间太短,目的 蛋白不是在pH6.5-pH8 范围内结合的 用pH 6.5 CpH 8.0的Buffer进行充分的平 衡 (例如PBS) . 目的蛋白没有完 全洗脱下来 洗脱体积太少 增加洗脱液体积,减小洗脱流速. 洗脱液中谷胱甘肽浓度太 低 增加洗脱液中谷胱甘肽浓度,可尝试用50 mM Tris-HCl, 20C40 mM还原型谷胱甘肽, pH 8.0洗脱. 低pH影响洗脱 在不增加洗脱液中的谷胱甘肽量时,提高洗 脱液中pH至pH 8C9 会有改善. 增加洗脱液中离子强度,如0.1C0.2 M NaCl. 洗脱液中的谷胱甘肽被氧 化 使用新鲜配制的洗脱液. 加入 DTT. 非特异性疏水作用影响目 的蛋白的溶解与洗脱 洗脱液中加入非离子型洗涤剂,如0.1%的Triton X-100 或者2%正辛基-β-D-吡 喃葡糖苷Tween-20. 电泳或western blot检测中发现 多条带 Mr

70 000 蛋白与目的 蛋白一起被纯化出来 Mr

70 000的蛋白有可能是大肠杆菌基因 dnaK 的产物,可以通过在目的蛋白中加入

50 mM Tris-HCl,

2 mM ATP,

10 mM MgSO4, pH 7.4在37°C加热10 分钟去除. 可以通过ATP-琼脂糖胶或离子交换来去除 目的蛋白溶液中的DnaK 蛋白. GST融合蛋白已经发生降 解 在裂解液中加入蛋白酶抑制剂,如加入1 mM PMSF. 有可能是蛋白酶对目的蛋白部分降解造成 的,可以使用蛋白酶缺陷型宿主菌(如lon- 或ompT). 细胞破碎过度 减少细胞破碎时间, 超声前加入溶菌酶(菌液 体积的0.1 倍的

10 mg/ml溶菌酶,

25 mM Tris-HCl, pH 8.0), 避免发泡导致蛋白变性, 过度超声破碎增加宿主内源蛋白与GST融 合目的蛋白的共纯化. 共价共纯化 包括促进蛋白正确折叠的分子伴侣的共纯 化,如:DnaK (Mr ~

70 000), DnaJ (Mr ~

37 000), GrpE (Mr ~

40 000),GroEL (Mr ~

57 000) 和GroES (Mr ~10 000). 可再进行一次纯化可以改善. 抗体与E. coli 的各种蛋 白反应 抗体吸附E. coli蛋白:GST-抗体. 超声处 理去除GST抗体,可以用Western Blots 检测.

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4 常州天地人和生物科技有限公司 5. 订购信息及相关产品 名称 货号 规格 Glutathione Beads SA008010 10mL SA008050 50mL SA008100 100mL SA008C 定制* GSTPur Glutathione Kit SA008K

3 次Glutathione Beads 4FF SA010010 10mL SA010050 50mL SA010100 100mL SA010C 定制* GSTCap 4FF SA010C11 1X1mL SA010C51 5x1mL SA010C15 1X5mL SA010C55 5X5mL SA010CS 3X1mL+1X5mL *定制是指向客户提供同一系列的非常规产品(包括不同的基质,不同载量或者大包装产品 等) .