PDF《技术报告》

参考文献 1.

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1984 Oct;

53(2):307-13. 临床与科研领域 炎症 技术报告兽医 犬CRP(cCRP)―系统性炎症标志物 反应蛋白(CRP) 是一种主要的急 相蛋白.在系统 性炎症发作期间,CRP的浓度水平会迅速显著升高;

随着炎症原的清除, CRP的浓度水平又会迅速 下降至正常水平.在急相 应答过程中,犬CRP(cCRP)的反应动力学与人CRP类似.当机体受到炎症刺激后,炎症细胞因子 会在很短时间内诱导肝细胞合成CRP.CRP同时也在先天 免疫应答中扮演重要角色,然而,其具体的生物学功能非 常复杂,仍没有研究透彻. C 人CRP已经广泛应用于炎症诊断及炎症严重性评估. 若干研究证实cCRP也是一种检测急相应答非常有价值的标 志物.在病毒或细菌感染、败血症及子宫积脓等多种炎症性 紊乱中均有发现cCRP浓度水平的迅速升高,同时在外科手 术中也可以检测到cCRP的升高(1-3). cCRP可作为诊断标志物 CRP属于正五聚体蛋白家族.CRP属于一个进化上非 常保守的蛋白家族――正五聚体蛋白,这类蛋白的特征是钙 CRP的生化性质 在很多情况下,cCRP的免疫检测试剂使用的抗体为抗 人CRP抗体.然而,两种CRP在血液中经历的修饰并不相 同.通常情况下cCRP为糖基化,而人CRP却为非糖基化. 因此,抗人CRP抗体与cCRP的交叉反应水平很大程度上取 决于抗体所识别的抗原表位,尤其是多克隆抗体,因为多抗 的批间差会导致差异进一步放大. HyTest提供若干单抗以及一种重组抗原,这些原料可 以用于开发灵敏且特异的犬CRP免疫检测试剂.我们提供 的抗体对于识别犬血清中的CRP具有高度的特异性及灵敏 度,并且对抗凝剂不敏感(如EDTA).我们已经在夹心免 疫、直接和间接酶免及蛋白免疫印迹分析系统中对这些抗体 进行了测试.同时我们也对这些抗体在其他平台上的应用非 常有信心. 重组抗原可以用于配制犬CRP免疫检测试剂的校准品. CRP免疫检测系统的原料产品 依赖的配体结合.正五聚体蛋白的主要功能是保护机体抵御 外来的和变异的抗原(4). CRP包含五个独立亚基,呈环状结构.CRP的分子量 约为115kDa,每个亚基含有204个氨基酸,分子量约为 23kDa.人CRP与犬CRP的主要区别在于犬CRP中的两个 亚基为糖基化亚基,而人CRP无多糖存在.

2 100 0.01 0.1

1 10

100 1000 CPS canine CRP (ng/ml)

100 0.01 0.1

1 10

100 1000 CPS canine CRP (ng/ml) 检测抗体 cCRP1 cCRP1 cCRP11 表1. 抗cCRP单抗的基本性能以及应用推荐 Mab cCRP1 cCRP3 cCRP11 cCRP34 亚型 IgG1 IgG2b IgG1 IgG1 抗原表位 构象位点 线性位点 构象位点 构象位点 夹心免疫 +++ - +++ +++ 直接ELISA + +++ - - WB - +++ - -

0 50

100 150

200 250

300 350

400 Dogs with inflammation Healthy dogs cCRP ( μ g/ml) PC-cCRP1 cCRP11-cCRP1 0.01 0.1

1 10

100 1000 CPS canine CRP (ng/ml) A B | 犬CRP(cCRP)―系统性炎症标志物 技术报告 夹心免疫分析系统检测cCRP 抗犬CRP特异性单克隆抗体 我们有四株特异性和灵敏度俱佳的抗体.这些抗体均 可应用于多种平台上的cCRP定量或定性检测试剂的开发. 这些抗体与犬血清中的其他组分无交叉反应,同时与人 CRP也无交叉反应.此外,用这些抗体测试猫、马、兔及 山羊血清时也未检测到反应信号. 其中有三株抗体非常适用于夹心免疫,另一株抗体在 直接ELISA及WB平台中表现优秀.关于四株抗cCRP单抗 的基本性能以及应用推荐请参见表1. 我们对抗cCRP单抗在夹心免疫分析系统中的表现进行 了测试.除了cCRP3,所有抗体在夹心免疫分析系统中均 可作为捕获抗体或检测抗体.单抗cCRP11(捕获抗体)和cCRP1(检测抗体)测试天然cCRP的校准曲线参见图1. 在夹心免疫荧光分析系统中,我们推荐的抗体配对具有很高 的灵敏度(0.1ng/mL)及很宽的线性范围. 抗体配对推荐请参见表2. 血清样本中cCRP的检测 我们对单抗测试血清样本中内源性cCRP的能力进行了 评价.测试结果显示,大多数抗体配对均能可靠地检出内源 性cCRP.我们对34例犬血清样本中的cCRP进行了测试, 其中包括患有不同原因的系统性炎症的样本及8例健康样 本,测试结果见图2.其中cCRP34和cCRP1分别作为捕获 抗体和检测抗体.结果显示,炎症个体样本中的cCRP浓度 显著高于健康个体. 钙离子缺失情况下cCRP的检测 据文献介绍,有很多cCRP检测方法使用的捕获分子为 交联了载体蛋白的磷酸胆碱(PC).PC作为特异配体对 cCRP具有很高的亲和力.然而这种结合非常依赖钙离子, 一旦钙离子缺失,反应会立即失效.相反,我们的单抗并不 会受钙离子的影响.图3显示cCRP11作为捕获分子,在钙离 子存在与缺失的情况下均可以灵敏地检出cCRP,而磷酸胆 碱在钙离子缺失的情况下无法捕获cCRP. 图1. 夹心免疫分析系统中天然cCRP抗原的校准曲线 cCRP11和Eu3+标记的cCRP1分别作为捕获抗体和检测抗体. 表2. 灵敏度最佳的抗体配对. 以下 数据均基于我们内部的DELFIA? 免疫分析系统 图3. PC与单抗cCRP11 分别作为捕获分子在钙离 子存在(A)与缺失(B)情 况下的性能对比. P C 与BSA交联,天然cCRP作为抗原,Eu3+ 标 记的cCRP1作为检测抗 体.反应缓冲液中分别添 加了2mM 钙离子(A)与5mM EDTA(B). 捕获抗体 异源夹心免疫 cCRP11 cCRP34 同源夹心免疫 cCRP11 图2. 炎症个体及健康个体血清中cCRP的浓度水平. cCRP34和Eu3+标记的cCRP1分别作为捕获抗体和检测抗体.

3 M nat. rec. <

a <

b kDa

70 -

55 -

35 -

25 - -

5 1

1 2

3 1

2 3 Glycoproteins Total protein A B 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

0 1

10 100 A,

450 nm cCRP3 (ng/ml) Ca2+ EDTA

100 0.01 0.1

1 10

100 1000 CPS canine CRP (ng/ml) Control PC BSA-PC 0.1 Ca2+ 磷酸胆碱的结合不会影响抗体对cCRP的检测 重组cCRP是部分糖基化的 图4. 磷酸胆碱的存在不会影响CRP在双单抗夹心免疫分析中的检测 天然cCRP作为抗原,Eu3+ 标记的cCRP1作为检测抗体.反应缓冲液中 分别添加了磷酸胆碱和磷酸胆碱-BSA交联物. 图5. 分别在钙离子与EDTA存在的情况下,使用cCRP3在直接ELISA 平台中对天然cCRP进行检测.将50ng 天然cCRP抗原包被于96孔板 上,然后用含有cCRP3的Tris缓冲液进行滴定,Tris缓冲液中分别添加 2mM 钙离子和5mM EDTA. 在个体发生系统性炎症及多发伤期间,源于细菌入侵 或细胞损伤所产生的磷酸胆碱可能会出现在血液中,使血液 循环中的部分CRP与磷酸........