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】 3) 探针准备:探针装载前,按照 1:1000 用无血清培养液稀释 DCFH-DA,使其终浓度为

10 μM. 4) 探针装载:去除细胞内药物,离心收集细胞,加入适当稀释好的探针,使其细胞密度为 1.0*

106 ~2.0*

107 /mL.【注】: 细胞密度需根据后续的检测体系,检测方法,以及检测总量来进行调整.如,对于流式分析,单管检测内细胞数目不少 于104 ,也不可多于

106 .每隔 3-5 min 颠倒混匀一下,使探针和细胞充分接触. 5)细胞清洗:用无血清细胞培养液洗涤细胞 1~2 次,以充分去除未进入细胞内的 DCFH-DA.

2 检测 原位装载探针法:激光共聚焦显微镜直接观察,或收集细胞后用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测. 收集细胞后装载探针:用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测,也可以用激光共聚焦显微镜直接观察.

3 参数设置 使用

488 nm 激发波长,525 nm 发射波长,实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱.DCF 的荧光光谱和 FITC 非常相似, 可以用 FITC 的参数设置检测 DCF.DCF 的激发光谱和发射光谱参考下图. 其他事项说明 1)对于刺激时间较短(通常

2 h 以内)的细胞,也可先装载探针,后用活性氧阳性对照和/或感兴趣药物刺激细胞,如阳性 对照刺激,应先加入适量探针于 37℃避光孵育

30 min;

然后再加入等体积 2*阳性对照 Rosup 溶液(200 μM),37℃避 光诱导

30 min-4 h;

2)阳性对照 Rosup 通常浓度为

100 μM.通常刺激后

30 min-4 h 可以观察到显著的活性氧水平升高.对于不同的细胞,活性 氧阳性对照的效果可能有较大的差别.如果在刺激后

30 min 内观察不到活性氧的升高,可延长诱导时间或适当提高活性 氧阳性对照的浓度.如果活性氧升高得过快,可缩短诱导时间或适当降低活性氧阳性对照的浓度. 3)对于某些细胞,如果发现没有刺激的阴性对照细胞荧光也比较强,可以按照 1∶2000~1∶5000 稀释 DCFH-DA,使装载 探针时 DCFH-DA 的浓度为 2~5 μM.探针装载的时间也可以根据情况在 15~60 min 内适当进行调整. 4)活性氧阳性对照(Rosup)仅仅用于作为阳性对照的样品,并不是在每个样品中都需加入活性氧阳性对照. 注意事项 1) 探针装载后,一定要洗净残余的未进入细胞内的探针,否则会导致背景较高. 2) 探针装载完毕并洗净残余探针后,可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描,以确认探针的装载情况是否良好. 3) 尽量缩短探针装载后到测定所用的时间(刺激时间除外),以减少各种可能的误差. 4) 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作.