PDF《菜用大豆液泡膜内在蛋白（TIPs）基因鉴定及表达分析》

23 个编码液泡膜内在蛋 白的大豆 GmTIPs 基因成员,并对它们的序列特征、 进化关系、干旱和高盐胁迫以及 ABA 和ACC 激素 应答模式进行分析,为菜用大豆抗逆分子育种理想 候选基因 GmTIPs 的筛选提供了理论依据.

3 1 材料与方法 1.1 大豆 TIPs 的鉴定 利用水通道蛋白保守结构域的隐马氏模型 (PFAM 号码:PF00230)[15] 、TIP 亚类水通道蛋白 的通路模型(KEGG 号码:K09874)[15] 以及已知的 拟南芥TIPs 蛋白序列(TAIR (http://ww w.arabidopsis.org/ ) [16] , 在大豆基因组数据库Phytozome v11.0 (http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html) 中查找 含有 TIP 特征结构域的候选蛋白序列.其中,已报 道的拟南芥 TIPs 蛋白具体注释如下[16] :AtTIP1;

1 (At2g36830)、AtTIP1;

2(At3g26520)、AtTIP1;

3 (At4g01470)、AtTIP2;

1(At3g16240)、AtTIP2;

2 (At4g17340)、AtTIP2;

3(At5g47450)、AtTIP3;

1 (At1g73190)、AtTIP3;

2(At1g17830)、AtTIP4;

1 (At2g25810)和AtTIP5;

1(At3g47440).进一步 利用SMART ( http://smart.embl-heidelberg.de/smart/batch.pl ) 和CDD ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd /wrpsb.cgi)鉴定候选蛋白保守结构域,合并冗余序 列,获得大豆 GmTIPs 蛋白序列.利用在线分析工 具ExPASy(http://web.expasy.org/ protparam/)预测 GmTIPs 的氨基酸长度、分子量和等电点. 1.2 大豆 TIPs 进化树的构建 使用Clustal X2软件进行大豆GmTIPs氨基酸多 序列比对和保守结构域分析.利用 NetPhos 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)对其磷酸 化位点进行预测[17] .使用 MEGA6.0 生成 GmTIPs 基因进化树,生成算法采用邻接法(Neighbor-Joining,NJ),校验次数为

1000 次. 1.3 大豆 TIPs 基因启动子中顺式作用元件分析 选取

1500 bp 的GmTIPs 基因上游 DNA 序列作 为 潜在 的启 动 子序 列, 进 一步 使用 PlantCARE ( http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcar e/ html/)数据库分析启动子作用元件,参数采用默 认值. 1.4 菜用大豆干旱和高盐胁迫及 ABA 和ACC 激素 处理 选取饱满的菜用大豆种子(种质编号GMLN012012017),每盆播种

4 粒,置于 22?C 光 照培养箱中培养 (16 h/

8 h 光/暗).将长势相近的三 周大幼苗根部分别用 20% PEG

6000、

250 mM NaCl、

100 μM ABA、100 μM ACC 浸泡处理,处理时间为

0 h、0.5 h、1.5 h、6 h、12 h.选取未处理(0 h)的 样品作为对照组[18] .进一步,分别将根和叶两种组 织样品于液氮中速冻并-80?C 超低温冰箱保存. 1.5 菜用大豆 TIPs 基因实时定量 qRT-PCR 分析 菜用大豆 RNA 提取参照天根 RNAsimple 总RNA 提取试剂盒说明书进行,cDNA 合成参照天根 FastQuantcDNA 第一链合成反转录试剂盒说明书进 行. 荧光定量 PCR 采用 KAPA SYBR?FastqPCR 试 剂盒进行,内参基因选择 GmActin11 作为参照[19] . 扩增反应的最佳体系为

20 μl,PCR 反应程序为:1 个循环,95?C 预变性

10 min;

42 个循环,95?C

7 s, 56?C

5 s,72?C

30 s;

绘制熔解曲线,0.2?C sC1 .试 验设置3次生物学重复. 利用2CΔΔCt 方法分析GmTIPs 基因的相对表达量[20] .

2 结果与分析 2.1 大豆 TIPs 的全基因组鉴定 从Phytozome 数据库共鉴定获得

23 个大豆 GmTIPs 基因(表1).理化性质分析发现,最长的 GmTIPs 蛋白序列含有

255 个氨基酸残基 (GmTIP3;

1 和GmTIP3;

2),最短的 GmTIPs 蛋白序列含有

237 个氨基酸残基 (GmTIP2;

7) ;

其中等电点范围从 5.08 (GmTIP2;

1 和GmTIP2;

2)到10.01(GmTIP1;

9), 分子量范围从 25.03 kDa(GmTIP1;