PDF《张珈 敏 ,郑 从义,胡 远扬》

第18卷 4期2003年 8月中国病毒学VⅡt OL OGI CA S I NI GA

1 8 ( 4) :

4 0

4 ―

4 0

6 Aug u s t

2 0

0 3 S ARS病毒的形 态结 构 及其 在体外培养细胞中的感染装配张珈敏 ,郑从义 ,胡远扬 ( 武汉大学生命科学学院,湖 北武汉,4

3 0

0 7

2 ) M o r ph o l o g y a nd I t s M o r p h o g e n e s i s o f t h e S AR S - Co V H b S t r a i n i n v i t r o Z H ANG J i a ― mi n , ZHE N G Co n g .

y i , HU Yu a n . y a n g ( C o l l e g e o fL i f e S c i e n c e s . Wu h a n Un i v e r s i t y , Wl l l n

4 3

0 0

7 2 , C h i n a ) Ab s t r a c t : Mo r p h o l o g i c a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f p u r i f i e d S AR S . a s s o c i a t e d v i r u s ( S ARS - C o V)f r o m Hu b e i p a t ie n t w a s c a r r i e d o u t b y n e g a t iv e s t a i n a n d u l t r a t h i n s e c t io n e l e c t r o n mi c r o s c o p y . Th e s p i k e o f i s o l a t e d S ARS . Co V v i r u s i s s h o r t e r a n d s m a l l e r t h a n Hu ma n c o r o n a v i r u s .A l a r g e q u a n t i t y o f S ARS - Co V p a r t i c l e s c o u l d b e o bs e r v e d i n t h e i n f e c t e d Ve r o c e l l s .T h e p r o c e s s o f i n f e c t i o n , a s s e m b l y a n d m or pho ge ne s i s wa s o bs e r v e d. ' Ke y Wo r d s : S A R S - a s s o c i a t e d v i r u s ( S ARS - C o V) ;

Mo r p h o l o g y ;

Vi r u s a s s e mb l e 关键 词:SARS病毒;

形态 结构 :病毒装配 中图 分类 号:R

5 1

1 :R

3 7

3 文 献标 识码 :A 文章 编号 :1

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3 ―

5 1

2 5 (

2 0

0 3 )

0 4 -

0 4

0 4 -

0 3 人冠状病 毒1965年 由Tyrrell等从人胎 儿器官 培养( HE T . OC) 中最初分离 . 其后 Ha mr e 和Ka p i k i a n 等 从组织培 养 中分离 了病毒l

4 j .2

0 0 3年 4月,世界 卫生组织 正式确认 ,引起 这次非 典型肺 炎(国外称 为重 症急性 呼吸综 合症 ,S e v e r e Ac u t e Re s p i r a t o r y S y n d r o me , S ARS )的病原体是冠状 病毒 的一个变 种SAR S . C o V,以前 没有在 人体 内发现过 .继加拿 大和美国之后 ,中国科 学院北京基 因组研 究所和 军事 医学科学 院微生物流 行病研究所 完成 了SAR S病毒 中国流 行株 的病毒全 基 因组 核苷酸序列测 定 ,证 实该病毒的基 因序 列与此前 发现的冠 状病 毒存在较大差异 ,属于一种 新的 冠状 病毒L

2 J .本研究利用 电 子显微镜 负染色技术和超 薄切片技术 . 分析 了2003年从湖北 S AR S患 者血清 中分离的冠状病 毒的形态 结构及在其 敏感 的体 外培养细胞 中感染 、复制 、装配过程.1材料 与方法病毒样 品取 自2003年湖北 S ARS患者初 期血 清 标本 .V e r o . E 6细胞由武 汉大学 中 国典 型培养 物 保藏 中心提 供 .将 处理好 的标本接种 于长成单层细 收稿日期 : 基金项目:作者简介:通讯作者:2003.07.02,修 回日期:2

0 0

3 .

0 7 .

0 8 湖北省SAR S研 究特 别基金资助.张珈敏(1956.),女,副教授,从事病毒生物化学研究.Co r r e s p o n d e n c e a u t h o r . 胞的细胞培养 瓶中,3

7 ℃吸附 l h ,吸 出标 本液 ,加 含有

2 %小牛血清 的细胞维持 液,置37℃CO2 培养 箱培养 .感染病 毒后不 同时间取材进行 电镜超薄切 片处 理 .病毒命名 为SAR S . Co V Hb株.病毒粒 子纯 化 :取 感染病毒

4 8 h后 出现严 重病 变 的培养细 胞 ,反复冻 融后

3 0

0 0 r / mi n

2 0 mi n离心 取上清 ;

3

0 0

0 0 r / mi n

2 h离心后沉淀悬浮 ,再经

3 O % 蔗糖单梯度 离心 ,洗 去蔗糖后 电镜 观察 . 电镜 观察:负染色样 品2%磷钨 酸( r ~ r A p H6 .

5 ) 染色 ,超薄切片按 常规方法 固定 、 脱水 、 浸透 、 s p u r r 树 脂包埋 、聚合 切片 .HI T AC HI H.

8 1

0 0电子显微 镜观察.2结果分析2.1SARS . C o V Hb株 感染细胞 的观察 取37"C培养箱 中培养

3 0 h ,细 胞处于对数 生长 期, 细 胞数约

7 *1

0 6 的Vero.E6细胞接种病 例标本 , 标本接种 V e r o . E 6细胞培养

4 8 h后 出现 明显 的细胞 病变 ,而且 能够 稳定地传代 ,其分离物 中经 电镜检 测含有大 量病毒粒 子 .将 稀释成

1 O .

4 的感染液接种 V e r o . E6细胞 ,于3h,12h,24h,48h进 行显微镜 观察 , 维普资讯 http://www.cqvip.com 张珈 敏,等.S AR S病毒的形 态结 构及 其 在体 外培 养 细胞 中 的感 染装 配405结果如下.未经接种 处理 的细胞 保持贴壁 生长 ,细 胞成多 边形与周 围细胞相连 ,细胞 内质 均匀 ,透 明发亮 . 接种

3 h 的细胞 单层形态完 整 、未发现 有 明显变化 ( 图1A) .接种

1 2 h的Vero―E6细胞可 以看 到少数 细胞已经变 园,出现 病变 ,但 大多数细胞依 旧完 整(图1B) .接种

2 4 h的细胞变 园 的数量增 多(未显 示照片 ) .4

8 h后,8

0 以上 的细胞单层存在 细胞变 园 、脱落形成 空斑 ,培养液 中也悬浮大量 脱落 的细 胞(图1C) . 图1SARS . Co VHb株感染的Vero细胞 Fi g.

1 I n f e c t e d Ve r o c e l l s b y S ARS ― CoV Hb A, Co nt r o l c e l l s ;

B, Ve r o c e l l i nf e c t e d b y S ARS― Co V Hb a f te r

1 2 h ;

C, Ve r o c e l l i n f e c t e d b y S ARS― Co V Hb a f t e r

4 8 h .

2 .

2 S ARS ― C o V Hb株 的形 态结构 提 纯后 病毒 粒子负染 色 电镜 图像 如图2A所示.病毒为近似椭园形且大小较一致,直径90~110nm的多形 态性 的粒 子 .病 毒囊膜表 面有钉 状 纤突( S p i k e ) .右下角为放 大 了的 S ARS病毒 ,可 以清晰 看到病毒囊 膜表面 的冠状 纤突 .这些纤突根 部细 、前端粗 园、长约

1 2 n m, 大而稀疏 的排列在 病 毒表 面 ,像花 冠一样 . 此次分离 的冠状 病毒的一个 显著特点是它 的花冠较小 .据 文献报 导,人 冠状 病毒粒子 表面纤突 前 端球部 直径为

9 ~

1 2 n m、 长度约 为20nm. T h o ma s 等报 告所分离 S ARS病毒 的囊膜 表面突起物 为20~ 40n m … . 而湖北分 离的 S ARS病毒 的花冠 明显偏 小,长度仅 为12nm,球部 的直径也 小得多 .纤突 由病 毒 的结构蛋 白 S蛋 白组成 ,是病毒 的主要抗原 ,它与SARS病毒侵 入细胞 的过程密切 相关 .一般 认为 冠状病 毒S基因的突变 与致 病机 理及毒 力改 变相 关,S ARS病毒较 人冠状病毒 的花 冠变 小可能是其 毒力增 强 的原 因之 一.2.3SARS病毒在 VE RO细胞 中感染装配 感染SAR S病毒3h的 V e r o ― E 6细胞变化 不大 , 但细胞膜 内外 已经 难见到吸 附和正在 进入 的病 毒 粒子 ( 图2B) . 病毒 的感染 与SARS病毒 的花冠和敏 感细胞细 胞膜 上 的受体 的相互识 别有关 .当SARS病毒 的花 冠特 异性 的与受体相 应 的调节部位 结合 时,引起受 体蛋白质 构象 的变化 使之激活 ,开始 细胞 内部 功能 活动一系 列变化 .S ARS病 毒入侵 细胞 的过程应该 与流感病 毒相似 ,即通过受 体介导 的胞 吞作用入侵 到细胞 内.由于 内吞泡 中的 p H 低 ,病毒囊膜上 的促融蛋 白质被激 活并和 内吞泡融合 ,病 毒核酸进 入 到胞质溶胶 中 ,开始其 复制 】 . 感染病 毒12h时, 培养的VE RO细胞里 已有少 数细胞 中病毒粒子完成 成熟装配 ,在细胞质 中 出芽 释放至细胞 内的空泡 中(图2C) .或者直接通过 细 胞质膜 出芽释放 至细 胞外 ,箭 头所示为 正在 和准 备 芽生释 放 的病毒 粒子 ( 图2D) .感染初 期的病毒粒 子装 配是在细 胞质胶体 中散在 进行 的,并逐渐聚集 在 一起 ,围绕在扩张 了的 内质 网周 围 向空泡 内芽 生 释放成熟病 毒(图2E) .此 时细胞 的线粒体还 是基 本完整 .有时可 以在 感染细胞 的细胞质膜 上看到成 熟 的病毒 粒子整齐 的排列在细胞膜外 面(图2F) , 随着 病毒 数量 的增加和 内质 网进 一步扩张 ,数 以百 计 的病毒 进入空 泡内,导致细胞破损 死亡 ,形成裂 解性 感染 ( 图2G) .成千 上万 的病毒和 细胞碎片又 开始感染其它 细胞 .在感染病 毒12h时 ,绝 大多数 细胞 中尚未见到病毒 出现 . 感染病毒

2 4 h后 ,已经有较 多细胞 出现病毒 的 复制和装 配 ,此 时的细 胞中经常可 以看 到球形 的包 块 ,内面充满未成 熟病 毒颗粒 .显示在 病毒复制装 配过程 中细胞亦可 能在进行 限制和 反抗 ( 图2H) . 而感染病毒

4 8 h 时,绝大多数细胞 已经是病毒感染 晚期 ,此时细 胞质 中的细胞器像 线粒体等 已无法分 辨 ,细胞 中出现许多 内质网扩张形成的巨大的空泡 . 此 次流 行传播 的SAR S病毒 是一种传染性 很强 的烈性病 毒 ,它在人体 内的侵染 、复制 、装配 、成 熟过 程及致病机制 目前 尚不清 楚 .病毒 感染 引起细 胞产 生 的特异性变 化也未弄清 .因此在体 外培养细 胞模 型 中观察 S ARS病毒感 染、复制 、装 配过程对 于我们 了解病毒 的感染过程 ,了解病毒 感染 引起 的 细胞变化 ,了解病毒 与细胞 的相互作 用具有重 要意 义 .从超微病理角度 直接观察 S ARS病毒感 染体外 培养细 胞过 程对于控 制SARS病毒 的研究来 说也是 一种重要的手段.参考文献[1】Th o ma s G Ks i a z e k D V M, Er d me n D, Go l d s mi 山CS, e l a1 . A No v e l Co r o n a v i r us As s o c i a t e d wi t h S e v e r e Ac ut e Re s p i r a t o r y S yn d r o me[ J ] . Ne w En g l J ME D,

2 0

0 3.

3 48 : (

2 0 )1

9 4

7 ―

1 95

8 . [

2 】 祝庆余,秦 鄂德,王 翠娥,等 .非典型肺炎病例标本中新 型冠状病毒的分离与鉴定fJ].中 国生 物工程杂志.200323:(4)106―112.[3】金奇.医 学分子病毒学[M】.北京 :科学出版 社,

2 0

0 1 .

4 保坂 康弘,松本 明.电子显微镜 图解病 毒学[ M】 .日本东京:朝仓 书店 .

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8 3 . 维普资讯 http://www.cqvip.com

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6 中国病毒学第18卷 图2SAR S ― C o V H b株 的形 态结 构及 在 细胞 中 的形 态发 生Fig.2MorphologYandmo r p h o g e n e s i s o f t h e S ARS ― Co V Hb i n Ve r o c e l l s Ar r o ws i n di c a t e v i r u s pa r t i c l e s a n d Ba r =

0 .

1 m i n t h i s f ig u r e A,El e c t r o n mi c r o g r a p h o f n e g a t iv e s t a i n i n g o f p u r i f ie d S ARS ― Co V Hb p a r t i c l e s ;

B.Th e S ARS ― Co V Hb p a r t i c l e s wa s i n c y t op l a s m a t

3 h ;

C, A s e c t i o n s h o we d v i r u s be g i n b u d d i n g a n d r e l e a s e i n g t o r o u g h e n d o p l a s mi c r e t i c u l u m va c u o l e a t

1 2 h ;

D, Ma t u r e d p a r t i c l e s we r e b u d d i n g a nd p r e p a r e t o bu d a t l

2 h ;

E. T h e p a r t i c l e s we r e ma t u r e l y a s s e mbl i n g (

1 2 h p i ) ;

F T h e ma t u r e d p a r t i c l e s we r e a r r a n g e d i n t h e e x t e r n a l me mb r a ne (

1 2 h p i ) ;

G,A s e c t i o n a l a rg e n u mb e r o f v i r us p a t i c l e r e l e a s e d t o o u t s t r e t c h e d e n d op l a smi c r e t i c u l u m v a c u o l e , a n d i t s me mb e r h a d r u p t u r e d (

1 2 h p i ) ;

H, A g r e a t d e a l o f i mma t u r e v i r us p a r t i c l e s we r e s u r r o u n d e d t o s p h e r i c i t y a t

2 4 . 维普资讯 http://www.cqvip.com