PDF《细粒棘球蚴中国大陆株亲肌肉基因分子克隆和序列分析》

文章编号: 1005- 8486(2006)03- 0185-

02 #论著# 细粒棘球蚴中国大陆株亲肌肉基因分子克隆和序列分析 张静, 赵嘉庆, 王娅娜, 张焱, 王淑静, 王洁, 高岭, 赵巍(宁夏医学院遗传学和细胞生物学教研室, 银川 750004) 摘要: 目的 获得细粒棘球蚴( E1granulosus) 亲肌肉基因( myophilin) 序列并进行序列分析.

方法 从包虫病患 者体内获取细粒棘球蚴原头蚴提取总 RNA, 根据 GeneBank 公共数据库检索出细粒棘球蚴亲肌肉基因的已知 序列设计一对引物, 采用 RT- PCR 技术扩增出细粒棘球蚴中国大陆株亲肌肉基因, 将其克隆到 pGEM- T 载体, 进行序列测定和分析.结果 成功扩增出细粒棘球蚴中国大陆株亲肌肉基因, 测序表明该基因为 573bp;

该基因序列与检索基因核苷酸序列相比, 同源性为 100% , 推导编码氨基酸序列同源性为 100% .结论 测序 的亲肌肉基因序列有完整的编码框, 可做为包虫病重组抗原的候选基因. 关键词: 细粒棘球蚴;

亲肌肉基因;

克隆;

序列分析 中图分类号: R38313+

3 文献标识码: A 收稿日期: 2005- 09-

06 基金项目: 国家自然科学基金资助项目( 项目编号 30260105) 作者简介: 张静( 1979- ), 女, 宁夏人, 在读 硕士研究 生, 从事寄生 虫病分子疫苗研究;

通讯作者: 赵巍( 1960- ) , 男, 河南人, 教授, 硕士, 硕士研究生导师, 从事分子生物学和寄生虫病分子疫苗研究. 细粒棘球蚴病又称包虫病( Hydatidosis) , 是一种遍布世 界的人畜共患病.在我国甘肃、 宁夏、 青海、 新疆等西部地 区及相邻地区流行[ 1] , 严重威胁当地人民的健康和畜牧业 的发展.近年来, 分子生物学技术的不断发展和广泛应用, 推动了基因工程疫苗预防各种传染病和寄生虫病的研究, 并且取得很大的成效[ 2] .相对而言, 细粒棘球蚴重组疫苗 的研究起步较晚, 因此, 本研究拟扩增出细粒棘球蚴中国大 陆株亲肌肉基因, 并进行序列分析, 为包虫病重组疫苗候选 基因的筛选和特性鉴定打下基础.

1 材料与方法

111 材料

1111 1 细粒棘球蚴原头蚴的收集: 无菌条件下抽取宁夏医 学院附属医院收治的包虫病患者手术摘除的完整包囊囊 液, 分离原头蚴, 经PBS( pH712)

3 次洗涤后, - 80e 保存.

1111 2 试剂: 总RNA 提取试剂盒Total RNA Isolation System 、 pGEM- T 载体、E1coli JM

109、 限制性内切酶 BamHI、 XholI、 X- gal、 IP TG、 RNA 提取试 剂盒、 RT- PCR 试剂盒均购自 Promega 公司, 200bpDNA Marker、 lambda DNA/ Hind? Marker 购 自北京华美公司, DNA 回收试剂盒购自北京塞百盛基因技 术有限公司, 质粒( 小量) 抽提试剂盒购自上海华舜生物工程 有限公司.

1111 3 RT- PCR 引物: 利用 GenBank 中检索到的细粒棘球 蚴亲肌肉基因序列( 序列号: Z29075) , 经DNAMan 分析软件 设计引物, 在两条引物上加上保护性碱基, 为了便于亚克 隆, 在引物

1 和引物

2 的两端分别引入了一个 BamHI 和XholI 的酶切位点: primerI: 5. ATGGATCCATGTCGAACGTTCCACCTCC3. primerII: 5. GCCTCGAGAATCTAATCCATGATCATGC3. 引物由北京赛百盛基因技术有限公司合成.

11114 仪器: 琼脂糖凝胶电泳装置( 北京六一厂) 、 PCR 仪 和凝胶成像仪( Bio- Rad 产品) 、 水浴振荡培养箱、 低温高速 冷冻离心机、 恒温水循环仪、 恒温培养箱.

112 方法

11211 细粒棘球蚴原头蚴总 RNA 的提取: 取新鲜的原头 蚴200mg, 按( Total RNA Isolation System) 试剂盒说明抽提总 RNA.