PDF《童L 姚萱》

2 3

3 2 方法

2 1 提 取病 毒抗原 以CN5株感染 C B MC s . 待CPE达

5 0 %~7

0 %时离 心收 获细胞 ;

快速冻 融 3次 并超 声粉 碎;

低速离心 后取上清 4℃

4 0

0 0

0 r / m i n超速离 心2h时.收获沉淀为病 毒抗原 .

2 2 制备抗 血清 以上 述病 毒抗原加弗 氏完全佐剂按常规方法免疫健康 成年家 兔.束次 注射后

1 0 d放血, 分离血清. 以该抗血 清通过偶联正 常CBMC s裂解物 的Sepharose4B层 析柱 , 亲 和层 析法 吸簖抗细 胞成分 抗体 经吸收的抗血 清再经 S e p h a d e x G

2 5分 子筛浓缩 . 常规方法对抗血清作 中和试验确定其效价.

2 .

3 间接 免疫 荧光法检 测病毒抗原 表述 C N 5株感染 C B MC s 后 分别于

4 、

8 、

1 2 、

2 4 、

4 8 h离心 收集细胞 , 涂片米感染的 C B MC s以同法处理作为对 照.用常规 方法 作间接免疫荧光染色,

1 :

2 0

0 0伊文思兰 复染

1 mi n . 荧光显微镜下观察

2 0 0个细胞, 计 算病 毒抗 原阳性细胞百分率 . 、

2 4 A P A A F ' 法检测 C D抗原 取CN5株感染

4 8 h的CBMC s 、 P B MC s 涂片以同一批 未感 染细胞 涂片作对 照 采用 T细胞亚群检测 试剂 盘, 以APAAP法检测 C D2 、 C D

3 、 C D

4 、 C D

8 、 C D

4 5 R A阳性细胞, 具体 操作按说 明书进行 显微镜 下观察

2 0 0个细胞 计 算阳性细胞百分率 .

2 5 MT T法检测 P HA诱导的细胞增殖 反应 取未经 超离心 的CN5株感染 C B MC 8裂解 液, 以紫外线 灭活

1 6 J / m

1 0mi n .未感染 C B MC s 裂解 液"同法处理作对照.用紫外分光光度计作蛋 白定量, 并调整 至所 需浓 度 .将 2*1 旷个/ mL的PBMC s 加入96孔细胞 培养板 .

1 0

0 r , L / 孔 .每孔再 加 入裂 解液、 P H A( 终浓度

5 g , mI ) 各50L.同时设 空白对照、 P H A对照.3 7℃、

5 %c 培养

4 8 h .于培养终 止前

4 h加Mn 试剂 , 按常规方法进行 细胞增 殖检测 结果1兔抗 H H V .

6 C N 5株特异性多克隆抗体的获得及其荧光染色 以CN5株病毒抗原免疫所获得的抗血清, 经亲和 层析法吸除其 中抗细胞成份抗体后, 对 病毒作中和试验 , 中和效价为

1 :

3 2 .在 间接免疫荧光试验 中只对感染细胞起 反应, 使细胞 内 染上黄绿色特异荧光;

而对未感染细胞则无反应, 细胞弪伊文思兰染成红色, 显示 了满意的特 异性 .间接 免 疫荧 光试 验 中的 效价 为1:4.特异荧光 初见于核 内呈 斑块 状,继而出现 于胞浆中及细胞膜上, 以后布满整个细胞.在涂 片操作过程中感染细胞形成的合胞体极 易破坏, 致细 胞裂 解,裂解物 呈荧光阳性 的 不规 则碎 片,或呈点状 , 或 呈钩 状 .感 染后8~1

2 h即可见明显的病 毒抗 原 阳性 细胞 , 其百 分率 在感 染后24h达

1 4 %、

4 8 %h达36%.

2 感染对 C D抗原阳性细胞百分率的影响 C N5株感 染 8倒 C B MC s 、 5例PBM后48h对 细胞 C D抗原 阳性 率的影响结 果 见表

1 . 衰l感染对脐血和成人外周血单个核细胞 C D抗旗阳性百分牢的影响 Ta b t e

1 Ef fe c t s 0t i n f ~d o n. n Cn p o s i t i v e c e l l p e r c e nt B g e s o f C BM Cs t md PBMCs 平均 C D抗原表达阳性细胞百分率 ( 均敦+标准差 ) C D 抗原――:竺竺:竺竺! 兰:竺竺竺竺 兰竺:竺! 竺!!!!脐血单十棱细胞( n =8 ) 成人外周血单十 攘细胞( n =

5 ) C B MC ~( n:8 】 P B MC s ( n =5 ) : 与对 照组 比较, P