PDF《C12P 19/12》

[19]中华人民共和国国家知识产权局 [12]发明专利申请公开说明书 [11]公开号 CN 1514005A [43]公开日 2004年7月21日[21]申请号 03122564.

0 [22]申请日 94.6.27 [21]申请号 03122564.0 [30]优先权 [32]1993.09.30 [33]JP [31]265416/1993 [32]1994.06.27 [33]CN [31]94107243.6 [71]申请人 株式会社林原生物化学研究所 地址 日本冈山县 [72]发明人 丸田和彦 久保田伦夫 杉本利行 三宅 俊雄 [74]专利代理机构 中国国际贸易促进委员会专利商标 事务所 代理人 程泳 [51]Int.CI7 C12P 19/12 C12P 19/14 C12P 19/16 权利要求书

3 页 说明书

62 页 附图

8 页[54]发明名称 非还原性糖类生成酶及其制备和应用 [57]摘要 公开了一种新的非还原性糖类生成酶及其制备 和应用.这种酶可从Rhizobium sp.M-11(FERMBP4 130)和Arthrobacter sp.Q36(FERMBP-4316)等微 生物的培养物中获取,当其作用于还原性淀粉部分 水解产物时可生成具有海藻糖结构的非还原性糖类. 当葡萄糖淀粉酶和α-葡糖苷酶作用于这种非还原 性糖类时,易于产生海藻糖.这种非还原性糖类和 海藻糖可广泛应用于食品、化妆品和药品中. 03122564.0 权利要求书第1/3页21.一种糖类组合物,其含有α,α-海藻糖和如下式所示的 非还原性糖类 Gn-T 其中,符号 G 表示葡萄糖残基: n 表示一个或多个 整数;

T 表示α,α-海藻糖残基. 2.权利要求1的组合物,其基本上由所述α,α-海藻糖和 所述非还原糖类组成. 3.权利要求2的组合物,其中所述非还原性糖如下式所示: Gn-T 其中,符号 G 表示葡萄糖残基;

n 表示1;

T 表示α,α-海藻糖残基. 4.权利要求1,2或3的组合物,其中所述α,α-海藻糖和 所述非还原性糖中的葡萄糖残基通过α-1,4键或α-1,6键结 合. 5.一种高α,α-海藻糖含量的产物,其通过如下方法获得: (a) 提供含有权利要求1-4 中任一项糖类组合物的溶液;

(b)将选自α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶和α-糖苷 酶的一种或多种酶作用于该溶液;

(c)将所得到的混合物经柱层析以除去杂质,增加α,α-海 藻糖的含量;

和03122564.0 权利要求书第2/3页3(d)收集高α,α-海藻糖含量的产物,其具有以干固体物计 的至少65w/w%的α,α-海藻糖. 6.一种制备α,α-海藻糖的方法,包括 a)部分水解淀粉性物质以获得还原性部分淀粉水解物,其含 有直链淀粉和/或麦芽寡糖;

b)使形成如下式所示非还原性糖的酶: Gn-T 其中,符号 G 表示葡萄糖残基;

n 表示一个或多个 整数, T 表示α,α-海藻糖残基;

c ) 水解所述非还原性糖以形成α,α- 海藻糖;

以及d)收集所得的α,α-海藻糖. 7.权利要求6的方法,其中步骤c)中的水解通过使用一种或 多种选自α-淀粉酶,β-淀粉酶,葡糖淀粉酶和α-糖苷酶的酶 来实现. 8.权利要求6的方法,其中步骤c)还包括氢化所得混合物中 剩余还原糖为糖醇的步骤. 9.权利要求6的方法,其中步骤c)还包括将所得混合物经过 带有离子交换剂的柱层析的步骤以除去杂质. 10.权利要求6的方法,其中步骤c)还包括将所得混合物中 的所述α,α-海藻糖结晶的步骤. 11.一种纯化α,α-海藻糖的方法,包括: (a)提供水性α,α-海藻糖溶液;

(b)浓缩水性α,α-海藻糖溶液;

03122564.0 权利要求书第3/3页4(c)将所得浓缩物中的α,α-海藻糖结晶;

和(d)分离并收集结晶的α,α-海藻糖. 12.权利要求11的方法,其中步骤b)中所述水性α,α-海 藻糖的浓度为范围约65-90w/w%,且所述α,α-海藻糖在所述 水性α,α-海藻糖溶液中的含量为以干固体物计至少65w/w%. 03122564.0 说明书第1/62页5非还原性糖类生成酶及其制备和应用 本发明涉及一种新的非还原性糖类生成酶,以及它的制备和应用 更具体地说,涉及这样一种新的还原性糖类生成酶:当其作用于一种 或多种具有3 个或3 个以上的葡萄糖聚合度的还原性淀粉部分水解产 物时,生成一种具有海藻糖结构的非还原性糖类,还涉及这种酶的制 备,以及能够产生这种酶的微生物.本发明还涉及含有可由这种酶制 备的以海藻糖结构为末端单元的非还原性糖类的组合物,含有上述非 还原性糖类的还原性比较低的糖类,和/或由这种糖类所制备的海藻 糖. 海藻糖或α,α-海藻糖长期以来一直被认为是由葡萄糖单元组 成的非还原性糖类.正如在Advance? in? Carbohydrate? Chemistry, 18卷,第201-225(1963)中(由美国的Academic Press出版)和在Applied? and? Environmental? Microbiology,第56卷,3213-3215页(1990)中所公开的,海藻糖广 泛存在于微生物、蘑菇和昆虫中,但含量较低:由于非还原性糖类包 括不会与具有氨基的物质,如氨基酸和蛋白质反应的海藻糖,所以它 们即不会引起氨基-羰基反应,也不会改变含有氨基酸的物质.因此, 非还原性糖类被认为可以使用而不用担心会引起不理想的褐变和变质. 因为上述原因,就迫切需要建立一种制备这种还原糖的方法在海藻糖的传统制备方法中,和在日本专利公开号No.154,485/75中所公开的,采用的微生物,或者如日本专利03122564.0 说明书第2/62页6公开号No.216,695/83中提出的,同时采用麦芽糖酶- 和麦芽糖磷酸化酶将麦芽糖转化成海藻糖.然而,前一种方法不适于 工业规模的制备,因为海藻糖在作为原材料的微生物中的含量以干固 体物计(d.s.b.)低于15w/w%( w/w% 的表达形 式在说明书中可简化为 % ,除非另有说明),且分离和提纯步骤 复杂.而后一种方案具有如下缺点: (i) 因为海藻糖是通过葡萄糖-1- 磷酸生成的,作为底物的麦芽 糖不能以较高的浓度使用;