PDF《CCK-8 试剂盒产品说明书》

Cell Counting Kit-8 弗元(上海)生物科技有限公司

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邮箱:[email protected] CCK-8 试剂盒产品说明书 产品编号: FY600001-1ML FY600001-5ML FY600001-10ML FY600001-100ML 存储条件: 2-8 ℃ 保存,有效期12个月;

-20 ℃保存,有效期24个月或更久;

避免反复冻融. 产品简介: CCK-8试剂盒基本成分是水溶性的WST-8,广泛应用于细胞 增殖与毒性的快速检测,对细胞无毒害.WST-8是类似于MTT的 化合物,与MTT不同的是WST-8具有很好的水溶性,因此检测过 程不需要破坏细胞,细胞可以继续应用于其他实验. WST-8可以被细胞内的脱氢酶氧化成水溶性的橙黄色的甲H 染料,生成的甲H量与细胞的数量和活力成正比.因此可以用甲 H在450nM处的光吸收表征细胞的活力. 自备耗材和设备:

10 μl 移液器或者多通道移液器 100-200 μl 移液器或者多通道移液器 带450 nm滤光片的酶标仪 平底96孔细胞培养板 CO2培养箱 适用实验与操作过程: 1. 细胞计数 制备细胞悬液,计数. 按比例(如1:2)用培养基稀释细胞悬液.一般需要做3-5个细 胞浓度梯度,每梯度至少做3孔重复,每孔100 μl培养基. 接种细胞4 h之后(贴壁细胞待细胞贴壁,悬浮细胞待细胞适 应),加入10 μl CCK-8试剂/孔.培养1-4 h后检测OD450. 以OD450值作纵坐标,接种细胞数作横坐标绘制标准曲线. 待测细胞接种处理方式同标准曲线,检测的OD250值带入标 准曲线公式,计算得到细胞数. 2. 细胞活性检测 在96孔板中接种细胞悬液,每孔100 μl,至少做3孔重复.将 细胞培养板37 ℃,5% CO2预培养一段时间. 每孔加入10 μl CCK-8试剂. 培养板在培养箱中培养1-4 h. 酶标仪检测OD450吸光值. 若不能立即测定,可每孔加入10 μl 0.1M HCl或者1%SDS, 室温避光保存.在24 h内测定. 根据OD值判断细胞活性,OD值与细胞活性成正比. 3. 细胞增殖与毒性检测 在96孔板中接种细胞悬液,每孔100 μl,至少做3孔重复.将 细胞培养板,按照实验设计预培养一段时间(例如多数情况为24 h). 在培养板中每孔加入一定量待测药物(化学药、生物药、生 物材料等,按照对数或线性浓度梯度进行设置分组). 在培养箱中培养适当的时间(例如6 h,12 h,24 h,48 h等, 具体时间根据实验内容确定). 药物培养结束,每孔加入10 μl CCK-8试剂. 培养板在培养箱中培养1-4 h. 酶标仪检测OD450. 若不能立即测定,可每孔加入10 μl 0.1M HCl或者1%SDS, 室温避光保存.在24 h内测定. 根据OD值判断药物对细胞增殖或毒性的影响,OD值与细胞 活性和数量成正比,与药物毒性成反比. 如果药物本身具有氧化性或者还原性,或者药物在OD450处 有光吸收,加入CCK-8前要更换新鲜培养基以去除药物,避免药 物对CCK-8试剂有影响,或者增加背景. Cell Counting Kit-8 弗元(上海)生物科技有限公司

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邮箱:[email protected] 常见问题: 1. 每孔应当接种多少细胞? 96孔板,每孔细胞接种量一般不低于1000个(100 μl培养基),推荐6000-10000个细胞.生长缓慢的细胞,如白细胞、神经细胞等, 接种量不低于3000个,最高可接种于100000个.推荐进行预实验确定最佳细胞接种量.若用24孔板或者12孔板等细胞培养板做实验, CCK-8的使用量等比例放大,即CCK-8加入量为培养基体积的1/10. 2. 如何确定CCK-8孵育的时间? 通常加入CCK-8后1-4 h之间测OD450.OD值在0.3-1.2之间为佳.细胞接种量大,细胞生长快,可以减少孵育时间,反之增加孵育时 间.可以每隔半个小时测一次OD450,确定最佳孵育时间. 3. OD值太低怎么办? 增加细胞接种量或者增加CCK-8孵育时间. 4. 如何设定空白对照? 不接种细胞的100 μl 培养基,加入10 μl CCK-8,测得OD450的值即为空白对照.加药物的实验中,如果药物在OD450有光吸收,则 空白对照为100 μl 培养基,加10 μl 药物,10 μl CCK-8,测得的OD450的值为空白对照. 5. 如何设定参比波长? 一般情况下不需要设定参比波长,当样品浑浊时,设600-650 nm的参比波长,消除浑浊因素造成光吸收. 6. 哪些物质对OD值测定有影响? 如果培养基中的物质(如酚红)在OD450处也有光吸收,会影响OD测定,此时可以用空白对照去除测定的影响. 如果待测药物在OD450处有光吸收,此时的空白对照中应当包含待测药物. 如果待测药物具有氧化性或者还原性,那么药物对OD450测定也有影响.一般来说,还原性的物质会增加OD值,氧化性的物质会降 低OD值.可以在加CCK-8之前换新鲜的培养基,去除药物的影响. 7. CCK-8对细胞有毒害作用吗? CCK-8对细胞的毒性非常低,检测结束,细胞还可以继续用于其他实验. 8. CCK-8的保质期为多久? 4℃避光保存,至少可以12个月,-20 ℃保存至少2年.保存时间稍长会使实验中背景值变高,但不影响使用. 9. 检测时必须用OD450吗? CCK-8检测时的甲H产物在430-490 nm之间都有光吸收,所以可以选择430-490 nm之间的其他检测波长,但是在450 nm时检测最灵 敏. 案例比较: