PDF《新型凝血酶电化学传感器的制备》

35 UV-Vis光谱仪, SB 2200型超声仪. 凝血酶(Thrombin, TB, Sigma), 6- 巯基己醇(6-Mercapto-1-hexanol, MCH, 97%, Sigma), 带巯基 的核酸适体(aptamer, apt, 序列: 5′-SH-(CH2)6-TTC CAA CGG TTG GTG TGG TTG G-3′, 宝生物公司), 柠檬酸钠,氯金酸,0.1 mol/L HCl,

10 mmol/L Tris-Acetate-EDTA buffer (TAE-NaCl, 含10 mmol/L Tris-Acetate-EDTA,

50 mmol/L NaCl), 1.0 mol/L PBS (1.0 mol/L NaH2PO4 + 1.0 mol/L Na2HPO4), 所有试 第2期叶树虹, 等: 新型凝血酶电化学传感器的制备

181 剂均为分析纯, 使用前未经纯化. 1.2 实验过程 1.2.1 AuNPs的制备 量取10 mL超纯水水于玻璃 器皿中, 加热至沸腾后加入5 mL 0.024 mol/L的氯金 酸溶液,在快速均匀搅拌的同时加入5mL 的0.1 mol/L柠檬酸钠溶液. 此时不要停止加热和搅拌, 可观察到溶液颜色由原来的灰色变为蓝色, 然后又 由蓝色又变为紫色, 最后变为酒红色. 这时停止加 热但要继续搅拌, 直到溶液冷却至室温, 取溶液进 行离心, 去除上清液. 溶液需在4 ℃条件下保存. 1.2.2 核酸适体标记的AuNPs的制备 将带有巯基的 核酸适体加入到1.0 mL的AuNPs溶液中, 在4 ℃的冰 箱中放置24 h, 使核酸适体中的巯基与AuNPs进行充 分反应. 将反应液离心, 弃去上层清液. 用1.0 mol/L 的PBS溶液洗涤沉淀, 再离心除去未反应的过量核酸 适体, 即制得核酸适体标记的AuNPs (Au NPs-apt). 将 制得的Au NPs-apt 放入4 ℃冰箱中保存备用. 1.2.3 修饰电极的制备 将抛光的金电极浸入到 1.0 mmol/L MCH+1.0 mol/L PBS 溶液中活化, 使MCH 通过Au―S键合到金电极表面形成自组装单层膜. 电极活化后需在凝血酶缓冲溶液中进行恒温培养. 再将电极浸入到Au NPs-apt溶液中进行培养, 制得 修饰电极, 如图1所示. 图1 电极修饰示意图 1.2.4 电化学扫描 在电化学反应池中加入 10.0 mL 0.1 mol/L 的HCl 溶液, 在1.25 V 恒电位下预氧化

2 min, 使AuNPs 氧化成 Au3+ , 然后立即在 0.25~0.80 V 电位窗下用差分脉冲伏安法进行反向阴极扫描, 得到 Au3+ 还原的差分脉冲伏安曲线.

2 结果与讨论 2.1 Au NPs-apt 紫外-可见吸收光谱表征 图2中的 a、b、c 曲线分别为 AuNPs、核酸适体和 AuNPs-apt 的UV-Vis 吸收光谱图. 由图

2 可知, AuNPs 在约

518 nm 处有特征紫外吸收峰(曲线 a). 而带有巯基 的核酸适体在约

254 nm 处有吸收峰(曲线 b), 该峰为典 型的寡聚核苷酸的 UV-Vis 吸收峰. 当AuNPs 与核酸适 体反应一定时间后, 核酸适体通过巯基自组装到 AuNPs 表面, 粒子半径增大使吸收峰由

518 nm 处红移 到约

528 nm 处. 在254 nm 处产生新的寡聚核苷酸的吸 收峰(曲线 c), 说明核酸适体已标记了 AuNPs. 图2UV-Vis 光谱图 2.2 实验条件的优化 2.2.1 电极活化时间的选择 图3为修饰电极在

1 mmol/L MCH+ 1.0 mol/L PBS 溶液中活化时间对 传感器检测凝血酶性能的影响. 具体实验方案为: 将抛光的金电极浸入到

1 mmol/L MCH+ 1.0 mol/L PBS 溶液中活化, 取出后再将修饰有 MCH 的电极浸 入到

5 μg/mL 凝血酶的 TAE+NaCl 溶液中, 在37 ℃ 恒温槽中恒温培养

2 h, 再将电极浸入到 Au NPs-apt 溶液中进行培养;

最后将修饰好的电极放在

10 mL 0.1 mol/L HCl 溶液中, 在1.25 V 恒电位下预氧化

2 min, 使AuNPs 氧化成 Au3+ ;

然后立即在 0.25~0.80 V 电 位窗下用差分脉冲伏安法进行反向阴极扫描, 得到 Au3+ 还原的差分脉冲伏安曲线, 如图

3 所示. 由图3 可知, 随着培养时间的增加, Au3+ 的还原峰电流增大, 当培养时间为 2.5 h 时达到最大. 由图