PDF《的比较》

cre/loxp;

cdc42;

acute lung injury;

vasopermeability 微血管通透性的增高在败血症性休克、 急性肺损伤 和ARDS、 烧伤等疾病的病理生理过程中起着非常重要 的作用, 抑制微血管通透性的增加对于控制上述疾病的 发生发展意义重大.对微血管通透性影响最重要的分 子是小 G 蛋白家族, 主要包括 RhoA、 Rac1 和cdc42. RhoA引起微血管通透性的增加, 而Rac1和cdc42则可 增强内皮细胞的屏障功能 [

1 ] .对cdc42在微血管中作用 的研究已成为目前国际上研究的热点.我们的前期工 作拟利用cre/loxp条件性基因敲除技术构建血管内皮 收稿日期: 2011-02-26 基金项目: 国家自然科学基金 ( 30971328;

309732129 ) Supported by National Natural Science Foundation of China (30971328;

309732129). 作者简介: 胡国栋, 在读博士, 主治医师, E-mail: [email protected] 通讯作者: 蔡绍曦, 博士生导师, E-mail: [email protected] ・ ・995 南方医科大学学报 (J South Med Univ) 第31卷 细胞特异性敲除cdc42基因的小鼠模型用于观察敲除 cdc42基因对急性肺损伤肺组织病理改变和微血管通 透性的影响.但血管内皮细胞特异性敲除cdc42基因 的纯合子小鼠在胚胎时期就已死亡, 无法发育成新生小 鼠.在本实验中, 拟观察比较血管内皮细胞特异性敲除 cdc42基因的杂合子小鼠与非基因敲除小鼠在急性肺损 伤中肺组织病理改变和肺微血管通透性变化的差异.

1 材料和方法 1.1 实验动物 血管内皮细胞内特异性表达Cre重组酶的杂合子 小鼠 ( Tie2cre+/- ) 已由合作单位北京军事医学科学院生 物工程研究所构建完成, 由杨晓教授惠赠 [

2 ] .该小鼠和 指示小鼠 ROSA26 转基因小鼠交配, LacZ 染色显示 Tie2-cre;

ROSA26双转基因胚胎的所有血管都呈现强 的β-半乳糖苷酶的活性而呈蓝染, 证明表达Cre重组酶 的血管内皮细胞具有组织特异性.Cdc42flox/flox 转基因小 鼠由美国辛辛那提大学Zheng Yi教授 ( Division of Ex- perimental Hematology, University of Cincinnati, OH 45229, USA ) 惠赠 [

3 ] . 1.2 主要试剂及配制 脂多糖 ( LPS ) 购自SANTA CRUZ;

甲酰胺购自科 昊生物工程有限公司;

伊文思蓝购自科昊生物工程有限 公司;

PCR引物由上海英韦创津生物有限公司合成. 1.3 血管内皮细胞特异性敲除cdc42基因杂合子小鼠构 建取Cdc42flox/flox 小鼠和血管内皮细胞上表达重组酶 Cre的杂合子小鼠 ( Tie2Cre+/- ) 杂交, 根据孟德尔遗传定 律, 将得到基因型为Cdc42 flox/+ Tie2Cre+/- 子代小鼠和基 因型为Cdc42 flox/+ Tie2Cre-/- 子代小鼠, 再取Cdc42 flox/+ Tie2Cre+/- 基因型的子代小鼠与Cdc42 flox/flox 小鼠回交, 根 据遗传定律, 其子代可能的基因型为 Cdc42 flox/flox Tie2Cre+/- 、 Cdc42 flox/+ Tie2Cre+/- 、 Cdc42 flox/+ Tie2Cre-/- 和Cdc42 flox/flox Tie2Cre-/- , Cdc42 flox/flox Tie2Cre +/- 为敲除cdc42基因的小鼠基因型, 此前的实验已证实, 该基因型 的小鼠在胚胎时期已死亡, 无法发育成成熟的新生小 鼠, Cdc42 flox/+ Tie2Cre+/- 基因型小鼠为敲除cdc42基因的 杂合子小鼠. 1.4 血管内皮细胞特异性敲除cdc42基因杂合子小鼠基 因型的鉴定 取小鼠的鼠尾, 常规方法提取DNA, 利用特定序列 引物, 采用PCR方法对小鼠基因型进行鉴定, 基因型为 Cdc42 +/+ 小鼠可见

600 bp 条带, Cdc42 flox/flox 小鼠可见

700 bp条带, 杂合子即基因型为Cdc42 flox/+ , 则可见600 bp和700 bp条带. 对表达Cre重组酶的情况需另外序列的一对引物 进行PCR鉴定, 表达Cre重组酶的小鼠PCR产物电泳可 见600 bp条带, 不表达Cre重组酶的小鼠无此条带. 1.5 各种不同的基因型小鼠实验分组 待小鼠的基因型鉴定完毕后, 根据小鼠不同的基因 型进行分组, 基因型为Cdc42flox/+ Tie2Cre+/- 为A组, 基因 型为Cdc42 flox/+ Tie2Cre-/- 为B组, 基因型为cdc42 flox/flox Tie2Cre-/- 为C组.A、 B、 C 三组小鼠的体质量分别为 ( 26.87±4.30 ) 、 ( 28.45±2.96 ) 、 ( 25.85±3.48 )g, 方差齐性 检验结果方差不齐, 采用近似F检验Welch法比较各组 小鼠体质量, 统计结果无显著性差异 ( P=0.424 ) . 1.6 急性肺损伤模型制作 用1%戊巴比妥钠麻醉小鼠, 切开颈部皮肤, 分离气 管旁肌肉和组织, 暴露气管, 将小鼠竖直倾斜约80 °, 在 气道内缓慢滴入 LPS ( 2.5 mg/kg, LPS 浓度为 2.5 mg/ ml ) , LPS给药后6 h检测相关肺损伤和肺微血管通透性 指标. 1.7 肺微血管通透系数测量及肺湿/干重比值测定 距设定观察时相点 (