PDF《BOSTER》

5 分钟*2 次;

0.5*SSC 洗涤

15 分钟*1 次;

0.2*SSC 洗涤

15 分钟*1 次.必要时可重复 0.2*SSC 洗涤

1 次.

8 滴加封闭液:37℃20 分钟.甩去多余液体,不洗.

9 滴加碱性磷酸酶标记小鼠抗地高辛:用0.5M TBS 按1:200 稀释,37℃60 分钟. 或室温

2 小时.0.5M TBS 洗5-10 分钟*4 次.勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤.

10 BCIP/NBT 显色:BCIP/NBT (*20)按1:20 的比例用 0.01M TBS(pH9.5)稀释,混匀.显色 液加至标本上.一般 30―37℃显色 30-60 分钟.也可以在室温或 4℃显色 1-24 小时.若无 背景出现则可继续显色,直至结果满意为止.充分水洗.

11 必要时核固红复染 5-15 分钟,水洗.

12 水溶性封片剂封片. 二.石蜡切片 如果有条件的话,应尽可能地采用新鲜标本.标本离体后,及时予以固定.固定液为 4%多聚甲 醛/0.1 M PBS(pH7.0-7.4) ,含有 1/1000 DEPC.标本较大时用刀片切成厚度不超过 4mm 的小块, 固定

1 小时即可, 较大的标本固定不要超过

2 小时. 某些组织对过度固定尤其敏感, 如动物大脑, 固定时间 30-40 分钟,一定不要超过

1 小时. 1. 常规脱水、浸蜡、包埋.切片厚度 6-8μ m. 2. 玻片的处理:一般采用多聚赖氨酸或 APES. 3. 石蜡切片经常规脱蜡至水. 4.暴露 mRNA 核酸片段:切片上滴加 3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加

2 滴浓 缩型胃蛋白酶,混匀) ,37℃或室温消化 3--30 分钟(视标本厚薄、新旧自行调整) .用户可以比 较不同的消化时间,例如

10 分钟,20 分钟,30 分钟,以找到最佳的消化时间.0.5M TBS 洗3次*5 分钟.蒸馏水洗

1 次. 其余步骤和冰冻切片 5-12 步相同. 结果观察:mRNA 的细胞胞浆着色呈紫蓝色. 注意事项:如果有少量的细胞核着色属于正常情况;

如果出现大量的细胞核着色,往往和标本固 定时间过长有关,应重新处理标本.有其它明显的非特异性染色现象时,可以用预杂交液对含探 针的杂交液进行稀释,一般稀释 2―5 倍.