PDF《传染性非典型肺炎患者不同病程粪便标本中SARS-CoV的分离...》

1 mL 生理盐水 振荡混匀 室温

5 000 rpm 离心3min. 取上清液

140 ?L 用来提取病毒 RNA 其余 上清通过 0.22 ?m 滤膜过滤 获得粪便浸出液 用于 病毒分离. 1.2.2 SARS-COV 分离 Vero-E6 细胞用含

100 mL/L 胎 牛血清的 DMEM 培养传代 细胞接合度达到 80-90% 时 接种粪便浸出液

1 mL 感染

2 h. 随后吸出粪便浸 出液 加1mL 上述 DMEM 置CO2 培养箱

37 培养.

2 d 后每天在显微镜下观察细胞状态 记录是否出现细 胞病变效应(CPE). 如果不出现 CPE 4-6 d 盲传1次. 传 代至出现

90 % CPE 时 收集病毒液 转到

25 cm2 细胞 培养瓶中放大增生. 富集足够的病毒 保存毒种 进行 电镜鉴定. 1.2.3 电镜和RNA样本制备 用QiAamp Viral RNA 提取 试剂盒(GIAGEN 产品)分别从粪便浸出液和出现CPE的 细胞培养上清液中提取 RNA 用于逆转录 PCR. 出现 CPE 的培养细胞用 20-30 mL/L 戊二醛固定液固定

2 h 用于电镜检查. 以上操作均在中国科学院北京基因组学研究所/北 京华大基因研究中心的 BSL-3 实验室内进行. 1.2.4 电镜鉴定 以30 g/L 磷钨酸溶液负染色 透射电 镜观察. 1.2.5 RT-PCR 检测 病毒 RNA 逆转录用 Promega 的Reverse Transcription System 按说明书操作. PCR 及巢

1246 ISSN 1009-3079 CN 14-1260/R 世界华人消化杂志

2004 年5月15 日第12 卷第5期式PCR 按常规方法进行[2, 8] . 1.2.6 血清抗体的测定 采用 ELISA 方法 用酶标仪 (Multiskan Ascent Finland)测定AD450(参考波长为630 nm) IgG 大于 0.18 IgM 大于 0.16 判为阳性.

2 结果 2.1 病毒分离和电镜鉴定 从12 例患者共

30 份标本中 成功分离得到

19 株原始分离物 多数标本用 Vero-E6 细胞盲传

3 代后即出现明显的 CPE(图1) 并能稳定传 代. 电镜负染检查从粪便浸出液接种的病变 Vero-E6 细胞均查见病毒颗粒(图2). 2.2 RT-PCR扩增结果 临床粪便样本30份直接用RT- PCR 法扩增 其中阳性

15 份 阳性率为

50 (15/30);

细胞培养病毒阳性19份经RT-PCR检测全为阳性 阳 性率为

73 (19/26)(表1). 对其中

12 例的粪便标本和细 胞培养分离物同时进行RT-PCR和巢式PCR(SARS73和SARS81引物及其相应的巢式引物) PCR反应产物的大 小与预期结果完全相同.

1 63/女03-5-16 03-5-20 03-5-23 03-5-27 03-6-03

24 28

31 35

42 + + + - - + + + + + + + + + + 0.489 ND 0.073 ND

2 48/女03-5-16

27 0.242 ND 0.076 ND

3 56/女03-5-16 03-5-20

32 36 + + + + + + ND ND ND ND

4 60/男03-5-16 03-5-20 03-5-23

58 62

65 - + + + NS + + NS + ND ND ND ND

5 35/女03-6-06

53 0.352 0.462 0.112 0.150

6 41/女03-5-16

33 ND ND ND ND

7 50/女03-5-16 03-5-20 03-5-27 03-6-3 03-6-6 03-6-9

30 34

41 48

51 54 - - + - - - + - + - NS + + - + - NS + 0.711 1.026 0.054 0.041

8 27/男03-5-27 03-5-30 03-6-6 03-6-09

12 15

22 25 - - - + + + - + + + - + ND 0.127 ND 0.031

9 48/男03-5-16 03-5-23

16 23 + - + NS + NS 0.061 0.148 0.057 0.072

10 48/女03-5-30

62 0.529 ND 0.041 ND

11 48/男03-5-27

19 0.051 0.115 0.010 0.016

12 30/男03-5-30 03-6-6 03-6-9

19 26

29 - - + NS - - NS - - ND 0.118 ND 0.021 表112 例SARS 患者粪便标本 SARS-COV 的不同方法鉴定结果 病例 年龄 / 性别 取样时间 病程(d) 临床样本 RT 分离结果 分离后 RT IgG IgM -PCR 结果 -PCR 结果 5.24 6.3 5.24 6.3 ND 未做, NS 无结果. ISSN 1009-3079 CN 14-1260/R 世界华人消化杂志

2004 年5月15 日第12 卷第5期1247 图1粪便样本传第