PDF《ExFect?2000 Transfection》

72 h之内进行优化. 08-2/ 转染体系调整 表一. 不同培养体系推荐初始转染条件 培养皿 96孔板 48孔板 24孔板 12孔板 6孔板

10 cm Dish Surface Area (cm2 )* Complex Formation Reaction Serum-free Media (μl) ExFect2000 (μl)

1 μg/μl plasmid (μl) Complete Growth Media (ml) 0.35

10 0.4 0.2 0.10 3.8

100 4

2 1.0 9.6

250 10

5 2.0

59 2000

60 30

10 1.9

50 2

1 0.5

1 25

1 0.5 0.25 初次转染某种细胞系时,不同培养体系推荐使用的培养基体积、DNA量、转染试剂量等参数可根据表一进行转 染条件优化. *数据来源于Greiner tissue culture和Falcon

10 cm dishes. 08-3/ 贴壁/悬浮细胞瞬时转染实验流程 (以24孔板转染为例) 细胞接种 1.转染前24 h左右对细胞进行转接,选取合适的接种密度确保24 h后细胞汇合度达到60%-80%;

2.过夜培养. www.vazyme.com 05/

06 09/常见问题与解决方案 转染效率偏低 ①ExFect2000与DNA的比例、DNA用量不合适 通过预实验测试ExFect2000与DNA的最佳比例(在1~3 μl ExFect2000/μg DNA范围内尝 试)及DNA的使用量(以24孔板为例,在0.5~1 μg/孔范围内尝试后,如不能满足要求,可适 当提高DNA用量,具体可参见表一).在后续的实验中选择转染效率高、细胞毒性低的比例 进行转染. ②将ExFect2000和DNA原液直接混合后加到培养基中 ExFect2000和DNA需分别在无血清培养基条件下按一定比例稀释后再进行混合孵育. ③转染时细胞密度不合适 多数情况下,当细胞汇合度达到60%~80%时转染效率较高.但是细胞类型不同,最适的 转染密度也不尽相同.推荐通过预实验寻找较优化的转染密度,并在后续实验中保持这个 密度. ④DNA质量偏低(降解或包含内毒素) 为实现高效率、低毒性的转染,应使用高质量的DNA(高纯度、无菌、无内毒素). 转染后细胞状态差 ①ExFect2000/DNA复合物转染后培养时间过长 多数情况下,在完全培养基中进行转染后,24 h内无需进行换液处理;

但是培养时间过长可能会导 致细胞状态较差,建议根据实验需要,合理安排后续实验时间. ②转染时细胞密度不合适 多数情况下,当细胞汇合度达到60%~80%时转染效率较高.细胞密度过低导致细胞生长缓慢,细 胞对外来试剂变得较为敏感;

细胞密度过高,会导致细胞发生接触抑制,加快细胞凋亡. ③ExFect2000与DNA的比例、DNA用量不合适 转染试剂过量会导致较高的细胞毒性.尝试降低转染试剂的使用比例或者减少DNA用量,具体优化 比例参见表一. ④ExFect2000/DNA复合物加入培养基时分布不均匀 局部ExFect2000/DNA复合物浓度过高是导致细胞毒性偏高最常见的原因之一.当复合物添加到培 养基之后,应平置培养皿,并前后、左右交替晃动. ⑤细胞状态偏差 传代次数太少或者太多都将导致细胞对转染试剂毒性敏感度的改变.因此应尽量使用适度传代的细 胞系,降低细胞代数差异对实验结果造成的影响. ExFect2000/DNA复合物包装 1.在1.5 ml无菌离心管中加入25 μl无血清培养基,并添加适量的ExFect2000转染试剂(1~3 μl ExFect2000/μg DNA,参见表一).用移液器轻轻混匀,室温静置5 min. 2.在1.5 ml无菌离心管中加入25 μl无血清培养基,并添加适量的DNA (0.5~1 μg DNA/孔,参见 表一).用移液器轻轻混匀,室温静置5 min. 3.将DNA-培养基混合物滴加到ExFect2000-培养基混合物中,用移液器轻轻混匀,室温静置 5~10 min后,立即转染. 混合好的ExFect2000/DNA复合物尽量在60 min内使用. DNA-培养基混合物和ExFect2000-培养基混合物的混合次序非常重要,切勿颠倒. 转染 1.将ExFect2000/DNA复合物滴加至培养基中.轻轻晃动培养皿以使复合物均匀分布. 如特殊情况,可在转染开始之前更换新鲜的含血清培养基,以防转染后孵育阶段细胞密度太大、营养 不足导致的细胞死亡. 2.过夜培养24~48 h. 如果转染后需要更换新鲜培养基,请于加入ExFect2000/DNA复合物4-12 h后进行.培养基更换后,再 孵育20~36 h后进行后续试验. 3.收取细胞,进行后续实验. ⑤ExFect2000/DNA复合物的包装体系中含有血清 若包装反应体系中存在血清,转染试剂/DNA复合物将无法正常形成. ⑥转染体系中存在转染抑制因素 当转染体系中存在多聚阴离子聚合物时(例如:硫酸葡聚糖、肝素等)转染将无法正常进行.因此应避 免上述物质存在于细胞转染体系中. ⑦细胞状态偏差 传代次数太少或者太多都将导致细胞转染效率的改变.为了提高转染效率以及转染稳定性,应尽量 使用传代适度的细胞系,并尽量在平行实验时保持细胞传代次数的一致性.