PDF《人类 疱疹 病毒 6型可诱生 TNF— a。》

第11卷第4 期1996年

1 2月中国病毒学VIR0L0GI CA SI NI CA V0

1 .

11 No.

4 De c.

19 96 人类疱疹病毒

6 型可诱生 T NF ― a . . 周7)'『/I21OO29)・_――――一---――――一'l/'、'ff(南京医科大学擞生物教研室南京lE'f^一:一6)GS株和南 京地 方株CN5.8.10盛染 的淋 E细 胞培 养上清 中的 肿瘤 坏死 因子 ( TN F) 的水 平,发现培 养24h即可检 出高 水平 的TNF ,

4 8 - -7 2h达到峰 值,此后逐 渐 下降 , 与未感染 对照 组 比较有极 诱生TN F也无 显著 性差 异( P>0 . O

5 ) .TNF―n单抗 可 以完全 中和 培养上 清中TNF的 活性 . 证实 上清 中 关键 词对免疫 功能的影响.其中HH V 一6感染对细胞因子 诱生的影响引起了人们的广泛兴趣【3-5】.1994年我 们从南京婴幼儿急疹患儿外周血单个核 细胞 中分离 出}mv一6南京 地方 株 .本 文通过生物活性法及双抗体桥联酶 免疫吸附试验, 证实 HH V ~6我国南京地方株和 国际 A型 标准株 GS感染淋 巴细 胞后 , 受染细胞均 可产生高 水平 T NF―n . 材料和方 法1HHV一6 毒株11HHV一6 GS株 由香港 大学微 生物 教研 室惠 蹭.

1 2 南京 地方 株CN株我室从 E S患儿 外周 血单十 核细 胞中分 离 培养 .

2 细胞

2 1 正常 新生 儿脐带血单十核细胞(CBMC s ) 健康产要的脐带血由南 京市妇产医院产房提供 . 用肝 索(62.5u/mL ) 抗凝 . 淋巴细胞分离藏分离.浓 度为2*l O *细晦[ mL .培养条件:20%新生牛血清的RP M[

1 6

4 0 . 古pHA

5 0 mL, 【 I 一21

0 u [ mL. 青、链霉 素分 别为

1 0

0 u / mL .接种 病毒 量为10TC[ D / mL , 并 以同 一批CBMC s同样培 养作 为未 感染 细晦对 照. 收集感 染后

2 4 h 、

4 8 h 、

7 2 h的培养上清 , 冻存于 一8

0 " C, 待检.22成人外 周血 单个核 细胞( A B MC s ) 取 健康 成人 外周血 . 其分离 、 培养、收集方 法同 C B MC s .

2 3 L 坤细 胞, 用含

1 0 %新 生牛血 清的 R P M I

1 6

4 0传 代培 养.

3 试卉 |

3 1 L P S(

1 0 mL )s i g ma产品 .

3 2 TNF ― a双抗 体 夹心桥 联酶 免疫 吸 附检 测试剂 盒 北京 邦定 生物 工程公 司提 供.33TNF - 单抗 第四军 医大学 免疫学教 研 室盘伯 泉教授 惠赠 .中 和试验 工作 浓度 为1:100.本文 于1996年 3月27日收到, 6月12日惨 回・本文为 国束 和 省教委 自然科学 基金 资助 课题 蠹堡一维普资讯 http://www.cqvip.com 第 4期 范萍等:^类疱疹 病毒 6型 可诱 生TNF - n

3 3

9 3

4 TN F - ~标准 品 为重 组^ TN F― 纯品.Sigma产品 .

4 T NF测定

4 .

1 生物 活性 法 按文 献【7】.咯有改变 . 简述如 下:29细胞 长成 单层后用

0 2

5 %的胰 酵消化.用Hank' s 液洗去胰 酵,调细胞浓 度为5*1 o

6 细胞/ mL 加入

9 6孔细 胞培 养板 中. 每孔

1 0

0 L.3 7℃

5 %c

0 2孵育

1 8 h后 去除 上清液 . 加 入倍 比稀 释的标本以爰 标准 品100孔.同时 每孔加入2嵋/ mL放线菌素D培 养液100L/孔.3 7℃ 孵育

1 8h后去 上清 , 甲醇 固定

3 旷, 结 晶紫染色

2 0mi n . 流水洗 净 细胞外 结 晶紫 , 用结晶紫抽 提液 (

0 . 1mo t / L磷酸氧 二钠 与95%乙醇等 量混 合)100孔溶解5mi n后+置酵 标仪 ( DG S

0 Z Z ) 甩570rtm滤色 片测OD值.TN F活性 单位 即50%细胞存 活时 的最 高 稀释 孔OD值 在标 准曲线上的对 应数值.再乘以稀 释倍 数.4.2免疫学 检测 采用双 抗体 夹心 桥联酵 免疫 吸附 试验 , 按试 剂盘说 明书操作 .