PDF《使用说明书》

Biotin-Protein Ligase / BirA Enzyme (生物素连接酶) 产品编号:BI001 包装规格:20 μg*2,

300000 U in total 产品内容 产品编号 包装规格 Biotin-Protein Ligase (1mg/ml) BI001-01

20 ?l*2 vials 10*Biotin Ligase Buffer A BI001-02

1 ml 10*Biotin Ligase Buffer B BI001-03

1 ml Additional D-Biotin BI001-04

1 ml (500 μM) 储存条件:-80℃密闭保存,低温运输.

? 产品概述 生物素连接酶 (Biotin Ligase、BirA、EC 6.3.4.15)能活化生物素形成生物素酰 -5'-腺苷酸,将生物素特异地转 移到生物素受体蛋白(如AviTag 融合蛋白)上,使蛋白生物素化. ? 来源 重组蛋白(Escherichia coli) ? 活性及纯度 Biotin-Protein Ligase 生物活性≥7,500 Units/μg 纯度>95%,无可检测的蛋白酶活性. ? 酶活性单位定义 底物蛋白(多肽)浓度为

40 ?M 的条件下,于30℃孵育

30 min,将1pmol 蛋白(多肽)生物素化所需的酶 量定义为一个活性单位. ? 储存条件 1. 干冰运送,解冻后分装,避免反复冻融;

2. 长期保存置于-80℃, 短期内使用置于-20℃, 频繁使用可短时置于4℃. 在4℃条件下保存三个月可保持>90% 的酶活性;

3. Ligase Buffer A、B 和D-Biotin 储存于-20℃,可反复冻融. ? 产品成分 Biotin Ligase 储存缓冲液:50 mM Imidazole,

50 mM NaCl, 5% Glycerol,

5 mM Mercaptoethanol, pH 6.8 10*Biotin Ligase Buffer A: 0.5 M Bicine,pH 8.3 10*Biotin Ligase Buffer B:100 mM ATP,

100 mM MgOAc,

500 μM D-Biotin D-Biotin:500 ?M D-Biotin 使用说明书 GeneCopoeia Inc.

9620 Medical Center Drive, Suite

101 Rockville, MD20850, USA Web: www.genecopoeia.com Tel (China): 4006-020-200 Web (China): www.igenebio.com ? 反应体系示例 反应物组成 体积 终浓度 10*Biotin Ligase Buffer A 2.5 ?l 1* 10*Biotin Ligase Buffer B 2.5 ?l 1* Biotin Ligase 0.17 ?l 6.4 ng/μl 蛋白(多肽)底物

1 nmol

40 ?M dH2O(灭菌蒸馏水) up to

25 μl 总体积

25 ?l,于30℃孵育 30~40 min 使底物完全生物素化. ? 注意事项 1. 本产品的底物为 AviTag 融合蛋白(http://www.genecopoeia.com/product/avitag/) . 2. Buffer A 和Buffer B 已经针对生物素化反应进行优化,底物浓度不超过

40 ?M.如果底物浓度达 40~80 ?M,则要加入额 外的生物素,反应如下:1 份10* Biotin Ligase Buffer A,1 份10*Biotin Ligase Buffer B,7 份酶底物混合物和

1 份D-Biotin.如果底物浓度超过

80 ?M,请酌情用

10 mM Tris-HCl, pH 8.0 稀释底物或与技术人员联系获取帮助. 3. 在相同的酶量下,高浓度的底物(高至

40 ?M)可以保证快速完成生物素化,底物浓度越低,生物素化所需时间越长.使 用相同量的生物素连接酶,40 ?M 底物可以在

30 分钟内完成生物素化,而4?M 底物则需要

5 小时.如果需要在

30 min 内使

4 ?M 底物完成生物素化,相同的底物量应加入

10 倍量的酶. 4. 如底物蛋白(多肽)需保存在较低温度时,可适当降低反应温度并应延长酶促反应时间. 5. 氯化钠(>100 mM) 、甘油(>5% W/V) 、硫酸铵(>50 mM)等许多常见的缓冲液成分会抑制生物素连接酶的活性.当底 物蛋白(多肽)确有必要使用这些试剂时,应尽量降低浓度. 6. 底物中可含有 Tris(pH 8.0), 最佳浓度为

10 mM,不超过

50 mM. ? FAQs Q:如何阻止蛋白酶降解底物? A:本产品的生物素连接酶经严格质量控制,没有蛋白酶活性.如果用于生物素化的底物蛋白是未经纯化的粗提蛋白,建 议加入适量的蛋白酶抑制剂,以防止在生物素化的过程中发生降解. Q:如何确定参与反应的最适本酶量及反应条件? A:由于不同蛋白性质差别很大、生物酶反应存在一定的不确定性,说明书中所述反应条件并不完全适用于所有蛋白.建 议用户可以进行预实验:可先取少量蛋白,分成若干份相同量的底物,加入不同稀释度的酶,相应量的 Buffer A、B,30℃

1 h(或其它时间、 温度条件) 反应, 以SDS-PAGE Loading Buffer 终止反应后, 电泳并转移至 NC 膜上进行 Western Blotting 检测(BSA 或脱脂奶粉封闭后直接以市售的 HRP-Streptavidin 孵育,DAB 显色) ,比较生物素化情况,选取最适条件.由于Streptavidin 与Biotin 结合力极强,因而用于 Western Blotting 检测时,只需很少生物素化蛋白即可观察结果. Q:如果我的底物蛋白浓度相当低且不容易浓缩,进行生物素化时该怎么办? A:在进行相同底物量的酶促反应时加入更多的酶并适当延长反应时间.但有一个问题不容忽视,酶是蛋白质,在酶量增加 的时候,引入体系中的蛋白量亦增加了,如果后续的实验不容许出现很大量杂蛋白,那么延长反应时间将是唯一的选择. Q:去污剂对于生物素化反应有无影响? A:经过实验检测,0.2%的Tween

20 对反应没有任何影响. 该产品仅限于实验科学研究用,若有任何单位或个人将该产品用于临床诊断、治疗等其他国家专门规定的特殊用途,本公司概不承担任何责任. 地址:广州高新技术产业开发区广州科学城掬泉路3号广州国际企业孵化器F区F801 邮编:510663 客服

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