编辑: 山南水北 | 2017-09-24 |
1 2月中国病毒学VI ROLOG I CA SI N I CA Vol
1 5 No
4 1 ) e e
20 0~
1 白志 强, 张友 清(中国 科学 院武 汉病 毒研 究所 .
武汉430071)摘要:以罹 病棉铃虫幼 虫 为材 料提 取总RNA , 反转录合成eDNA第一链,加otigo(dG) 同聚培, P CR 扩增合成双链 c DNA, 克隆 到pGEM. T质粒载体中. 随 机筛 选 文库 中 阳性 克隆 , 经 酶切 分扫,cDNA 插入片段 太小在0.3~1.1kb之 间. 文库中原 代重组子 数为1.66x l O
5 , 重组 百分比为878%.重 组质粒的杂交分 析表明,文库中Ha NP V基困的cDNA克隆 所占比例超 过50%. 关键调: ! 垦塑墼枢型 查鱼整堕壹;
聚合酶链反应;
磐;
eDNA中宙分类 号:$4356229文献标识 码:A文章编号 :
1 0
0 3 ・
5 1
2 5 (
2 0
0 0 )
0 4 ・
0 3
4 6 ・
0 4 中国 棉铃 虫(He l i o t h e s a r mi g e r a) 是危害棉花 、 烟草、辣椒、番茄等的主要害虫之一'.作为无公 害生物 农药 , 中国棉 铃虫 核 型多角体病 毒( Ha NP V) 已于
1 9
9 4年 在我 国登记 注册,取得了良好的 应用效 果和 经济效 益. 自七十年 代以来 . 科 学工作 者对 Ha NP V 进行 了大量 的研 究工 作,包括 生物活性测 定, 理 化性 质分 析,血清学性 质等方面H 】 . 本文以HaNP V 感染的棉铃虫幼虫为材料. 构建了Ha NP V罹病 幼虫潜伏期cDNA文库,为深入研 究Ha NP V 的分子生物学奠定 了基础.1材料与方法j1材料1l1质粒 和菌种:质粒pGE M. T 购自Prome r g a公司,大肠杆菌 E c o l i DH5 a为 本实 验 室保 存.1l2工具酶和其它分子生物 学试剂:DNA s e I、 Td T酶、IPTG、 x・ g a l 、 小牛恂腺 D NA购白Prome r g a公司, M. ML V 贿自GI B C O公司, DE P C 购自Fluka公 司,CTAB贿自Sigma公司Ta q酶、dNT P s 、 RNa s i n和碾制性内切 酶购自SAB C公司.长臂 光敏生物 索探 针 标记 试 荆盒 购 白军 事 医学 科学 院放射医学 研究所12方法1.2.1引物合 成:参考文 献-'1合成两个 通用引物 . P 设有 E mR I酶切位点中设 有EcoRI千 ¨ 卅H J两 个酶 切位 点.引物 序列如下所 示:P1:GAA P
1 : G AA TT C GGA
1 . 2.
2 总RN A 的提 取 及纯 化:以纯 化HaNP V 病毒多角体感染棉铃虫幼虫.4
8 h后,取活虫l:球潜中迅速匀浆 , 改 良异 硫氰酸眦法 提取总RNA [ . - , 用无RNA 的DNa s e I降解 残量DNA .
1 2 .
3 c DNA第一链的 合 啦及 过量引物的 去腙 : 取l~3 g纯化总RNA, 加^ 引物P和RNa s l n
7 0℃ 温10mi n , 冰浴中冷 却5rai n , 依次 加入其它成分 ,
3 7℃ 保温
2 h .E DT A 终 止反 应,10%C TA B重复沉淀两次.乙收稿日期 :
1 9
9 9―0 7一】
3 恬回日期 :
2 0
0 0―0 I 一0
3 作者简升 : 白志 强(1973年 一) 男. 河北 鹿 泉人 . 实习研究 员. 硕士 . 主 要从 事 昆虫 病毒 学 研究 通 讯作 者:张友 清(1941年一) . 男. 湖北仙桃 人. 研究员,主要 从 事昆 虫病 毒学 及 昆虫 病 毒乐 虫荆 应甩面的研 竞 维普资讯 http://www.cqvip.com 维普资讯 http://www.cqvip.com 中国病毒学第l5卷 P v 的mR NA 是至关重要的一步.在 逆转录和PCR操作中,特别应注意排除引物和小分子cDNA 片段 的 干扰 .我们在 实验 中发现 , 过量 的引物会 降低或抑 制cDNA的扩增, 而过 多的 小 分子 c D N A 片段则 会抑制大 分子 e D NA片段的 有效 扩增. l
2 A B C D E F 羹霉图2部分重组质粒的点杂交分析Fi g.
2 Do t h dl nt _ 啪of c . mb j r mm p h. * ml d s wi t h g e n ~n a ]p r o b e 0f Ha NPV A1 ~x , l t i v e e o mr d B1 n e g a t i v e amt ml H a NP v罹病幼虫 e D N A文库 的构建 , 有助 于获得 Ha NP V 病毒 与宿 主 昆虫 相 互作 用 条件 下表达 的基 因, 在基 因水平上深 入 了解 Ha NP V 病 毒与宿 主 昆虫相互 作用的分 子机 理, 井进 一步分析 Ha NP v 基 因表达及宿主 反应 情况.对 于研 制 更好 的病 毒 杀虫 剂,克服 潜伏期棉铃 虫 造成 的危 害, 提 高病 毒治虫 的效 果具 有重 要意义 . 参考文献【1]张友 清.汤显 春.葛珞.等棉特虫 多培悻病 毒杀 虫荆 【 J ] 中 国棉 花.