PDF《4 卷第4期》

6 7种L B J .与MNP V相比, S NP V 的分子生物 学研究还 十分贫 乏.为此, 从80年代末 起,我们全面开展了对 B u s u NP V的分子 生物学 的研 究, 构建 了该病 毒的基 因文库 、 物理 图谱, 并选择基 因组 中的不 同 区域进行 了序 列分 析【

9 ".本文 具体 报道 B u s u NP V 基 因组上 一个

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2 2 b p 的BamHI H 片段 的序列分 析结 果, 并将该 片段 上基 因的排列 顺 序与 Ac MNP V相应基因的排列顺序进 行比较 .

1 材 料和方 法1.1材料 及试 剂 油桐 尺蠖单 粒包 埋核 型多 角体病毒 的 原始 株.是从 湖北 蒲圻 羊 楼洞 茶场的捕 死虫中分离 获得 的l

6 ;

质粒载 体pTZ I

9 R及宿 主菌 D a由本 实验 室保藏;

限制性 内切酶 、 连接 酶、去磷 酸化酶及缺刻平移试剂 盒均 购 自华荛 生物工 程公 司.1.2病毒DN A的提取 爰限 制性 内切酶 分析 B u s u NP V 多角体饲 喂感 染油 桐尺蠖幼 虫,虫体 死亡后.研睹过 滤.多角体经差 速 离心纯 化,显微镜 下计 数.取3*1

0 十 多角 体 离心, 加^ 蛋 白酶 K(

2 0I ' l l g / mL5 L ,

3 7℃作用30r ai n 加入500, a L喊解液 (

0 .

1 t oo | / LN.

2 C O , ,

0 .

0 1 t oo | / LE DT A,

0 .

1 7mo ] l I N a C I , p H>1

0 .

8 ) ,

3 7℃ 作用

3 0 r ai n ;

加入

1 0%S DS至终浓 度1%,

3 7 ℃ 作用

3 0r ai n ;

酚、酚:氯仿 : 异戊 醇(2S:24:

1 ) 及氯仿:异戊醇 (

2 4 :

1 ) 各抽 提 一次 后.

0 1 *T E( p H8

0 ) 透析

4 8 h , 分 光光 度计 测定 其纯度 及浓 度. 取1DNA进行 内切 酶 消化 , 限 翩性 内 切酶 消化条 件接 常规 方法进 行.0 .

7 %琼 脂糖 凝胶 电{ 隶.

1 .

3 克隆 爰测序 紫外灯 下切取 目的带 , 液 氯冻 融法 回收 , 与BamH! 消化 并击 磷 酸化 的载 体pTZI9R14℃连接过夜 , 转化 大脑杆菌 D n .阳性克 隆经限制性 内切酶分析及 S o u t h e r n b l o t 鉴定.利用通 用 引物 和合 成引物 以 引物 延伸法 ( P r i me r w a l k i n g ) 进 行序列 授I定, 自动序列 测定 在加拿 大Qu e s 大学 的测序 实验 中心进行 .

1 .

4 序 列分析 序列 用UWG C G计 算机软 件(release90)分析 , DN A序 列和编 码 的氮基酸 序 列用 F A S T A和BLAS T 软件 与GenBanl,/EMB

1 S wi s s p o r t 及PIP.数据 库进行 比较 分析 , 运用GeneDOC软件进行 氨基 酸 序列及 同源性 分析.2结果及讨论 限制性 内切酶分析及 S o u t h e r n b o l t 结 果表明, B u s u N P V

2 .

4 k b的BamHI . H 片段 已被 成 功地克隆在载体 p T Z

1 9 R上(图略) .以引物延伸法对 阳性克隆 中插入 片段的两条链进行 全序 列测定 , 结 果表明, 该 片段垒长为

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2 2 b p , 包括 三个开放 阅读 框:7基 因( A c MNP V O R F

4 0 的同源 区) 的5端,完整的组 织蛋 白酶 ( c a t h e p s i n ) 基因(Ac MNP V OR F

1 2 7的 同源 区) 和p74基因( Ac l v h - NP V ORF l

3 8的同源 区) 的3端(图1,2),其结 构特 征分述如 下:2.17基 因BamI - I I . H 片段 编码7基 因的N端193个 氦基 酸,该序列 与AcMN P V OR F

4 0所编码 的氦基酸序列 同源 .B u s u NP V 7基 因的起始密 码子上游第

1 6位有一杆状病 毒早期基 因转 录起 始信 号CAGT 【 t

2 ] , 在一1

0 0位和一1

2 0位有两个早期启动子 组成元件 TA TA.完整的AcMNP V 7基 因编 码一分子量为47.5kDa的多肽u,据推测为杆状病毒自身 R NA聚台酶的亚单位, 参与晚期及极晚期基因的转录 与表达 L l .到 目前为止 ,有 4种 杆 状病毒的 7基 因序列 已被测定, 它们是 :Ac MNP V【 t s ] 、B mNP V_