PDF《第21 卷4期》

340 中国病毒学第21 卷合物(Heat Shock Protein Peptide Complex , HSPPC)能诱导特异性抗病毒 CTL 反应[1~4] ;

体 外将 HSPs 与HIV-1 p24,HBV, HPV16-E7, HSV, LCMV 或卵蛋白混合能有效刺激抗病毒体液保护 和细胞免疫反应[5~8] .而将 Hsp70 用于汉坦病毒 的免疫研究尚未见报道.本研究利用原核表达的 融合蛋白 Hsp70-NP 以及 NP 免疫小鼠,观察比较 淋巴细胞增殖指数及对靶细胞的杀伤效率,以明 确Hsp70 是否具有增强 NP 诱导细胞免疫反应的 能力.

1 材料与方法 1.1 实验材料 质粒 pcDNA3.1/S 由本室高娟硕士构建, 含有 完整的汉坦病毒 76-118 株的核蛋白编码区基因. 脂 质体 Lipofectamine

2000 购自 Invitrogen 公司;

G418,CytoTox

96 检测试剂盒购自 Promega 公司;

新生小牛血清购自杭州四季青公司;

1640 购自 Gibco 公司;

细胞 RNA 提取试剂盒购自 U-gene 公司;

逆转录酶 AMV 购自 Promega 公司;

羊抗鼠 IgG-HRP,羊抗鼠 IgG-FITC 购自中杉公司;

鼠NP mAb (1A8)由本校微生物教研室惠赠;

化学发光液 为Pierce 公司产品.其它所用配制各种液体的化学 试剂均为分析纯或分子生物学纯级. 1.2 B16-N 稳定转染克隆的筛选 B16 细胞培养于含 10%新生小牛血清的

1640 培养液,37℃,5%CO2 条件下.转染采用脂质体 Lipofectamine2000 介导的方法,具体操作方法按照 说明书进行.转染后

24 h 按1:10 稀释传代, 次日 加入 G418 终浓度为 800ng/mL 筛选.采用有限稀 释法在

96 孔板内进行克隆化. 1.3 RT-PCR 检测 对10 个克隆的细胞进行总 RNA 提取,具体操 作方法按照说明书进行.采用逆转录酶 AMV (Promega) 从总 RNA 中转录出 cDNA 并进行 PCR 扩增.引物包括 S 基因全长,设计如下:P1:5'

GC GAA TTC ATG GCA ACT ATG GAG GAA TTA C 3'

P2: 5'

GC CTC GAG TTA GAG TTT CAAAG G CTC TTG G 3'

. 1.4 Western blot 检测 分别收集同样

10 个克隆的细胞 1*107 ,加入 蛋白上样缓冲液,100℃煮沸 5min,离心后进行 SDS-PAGE.Western blot:一抗为鼠 NP mAb (1A8, 1: 4000);

二抗为羊抗鼠 IgG-HRP(1: 5000) . 1.5 免疫荧光检测 制备细胞爬片,4%多聚甲醛固定.一抗为鼠 NP mAb (1A8,1: 2000);

二抗为羊抗鼠 IgG-FITC (1: 64) . 1.6 蛋白制备 融合蛋白 Hsp70-NP,蛋白 NP 以及蛋白 Hsp70 的原核表达及分离纯化详见另文.分离的蛋白 4℃ PBS 透析 48h,Brandford 法测定蛋白含量,分别采 用PBS ........