PDF《产品信息》

:5'

完整性分析(3)也能用于 检测 RNA 样本的完整性. RNA 量?使用

1 pg-5 μg 总RNA、0.1 pg-500 ng 含poly(A)的mRNA 或者 0.01 pg-500 ng 特异 性RNA 来合成 cDNA 的第一链,作为两步 RT-PCR 法的第一步. ? 使用

1 μg 分离的 mRNA 合成 cDNA 第一链, 用于 cDNA 第二链合成及下游的克隆反应. 引物 第一链 cDNA 合成能够使用 Oligo(dT)18 引物、随机引物或者基因特异性引物. Oligo(dT)18 引物针对具有 poly(A)尾的真核生物 mRNA 合成 cDNA.随机引物适 用于总 RNA 的cDNA 合成.因此,使用随机引物合成 cDNA 第一链,其产生的 cDNA 复杂 性要远高于使用 Oligo(dT)18 引物.结果会导致下游 PCR 反应的灵敏度和特异性降低.但是,在一些情况下使用随机引物更具有好处,比如使用无 poly(A)尾巴的 mRNA 作为模 板合成 cDNA,或者使用富集 poly(A)的RNA 作为模板合成 cDNA.基因特异性引物常

6 用于从总 RNA 或mRNA 中合成特异性的 cDNA,此引物须由使用者设计完成. RT-PCR/RT-qPCR 的对照反应 实验中应利用如下负对照来确认 cDNA 第一链合成的结果. Reverse transcriptase minus(RT-)负对照:RT-PCR 和RT-qPCR 中应利用此负对照来 检验 RNA 样本中基因组 DNA 的污染情况.此负对照 RT-反应含有除 Maxima H Minus Enzyme Mix 以外的所有组分. 无模板负对照(NTC) :此负对照用来检验试剂污染情况.NTC 反应含有除模板以外的 所有组分. 实验方案 开始前请阅读本手册的重要提示部分(第5页) . RT-PCR Ⅰ.第一链 cDNA 的合成 解冻后,轻轻涡旋并短暂离心试剂盒所有组分.冰上放置. 1. 于冰上将以下试剂按标明的顺序加入到无菌的、无RNase 的反应管中. RNA 模板 总RNA 或poly(A)mRNA 或 特异性 RNA

1 pg-5 μg 0.1 pg-500 ng 0.01 pg-500 ng 引物 Oligo(dT)18 引物 或 随机引物 或 基因特异性引物

1 μl(100 pmol)

1 μl(100 pmol) 2-20 pmol

10 mM dNTP 混合物

1 μl(最终浓度 0.5 mM) 无核酸酶的水 至15 μl 2. 可选. 如果模板 RNA 富含 GC 或者已知含有二级结构,轻轻混匀并短暂离心,65℃孵育

5 分钟.冰上冷却,再次短暂离心后置于冰上. 3. 按标明的顺序加入以下成分: 5*RT 缓冲液

4 μl Maxima H Minus Enzyme Mix

1 μl 总体积

20 μl 轻轻混匀并离心. 4. 孵育: ―如果使用 Oligo(dT)18 引物或基因特异性引物,在50℃下孵育

30 分钟. ―如果使用随机引物,在25℃下反应

10 分钟,之后 50℃下孵育

30 分钟. ―对于富含 GC 的RNA,孵育温度可以升高至 65℃.

7 5. 85℃加热

5 分钟以终止反应. 第一链 cDNA 合成产物能够直接用于 PCR,或者在-20℃条件下存放一周.如需长时间 贮存,推荐贮存于-70℃.另外应避免 cDNA 的反复冻融. Ⅱ.PCR 第一链 cDNA 合成产物能够直接用于 PCR.加入的合成的第一链 cDNA 产物体积不应 超过 PCR 反应总体积的 1/10. 通常情况下, 在25μl 体系的 PCR 反应中加入 2μl 合成的 cDNA 第一链作为模板.Taq DNA 聚合酶、PCR Master Mix、Maxima? Hot Start PCR Enzyme Mix (2*)能够用于扩增小于 3kb 的片段.Thermo Scientific Dream Taq DNA 聚合酶适于扩增 长达 6kb 的片段. Long PCR Enzyme Mix 和High Fidelity PCR Enzyme Mix 适于扩增长达 20kb 的片段. RT-qPCR Ⅰ.第一链 cDNA 合成 下列优化方案用来在两步法 RT-qPCR 中合成第一链 cDNA.解冻后,轻轻涡旋并短暂 离心试剂盒所有组分.冰上放置. 1. 在冰上,将以下试剂按标明的顺序加入到无菌的、无RNase 的反应管中. RNA 模板 总RNA 或poly(A)mRNA 或 特异性 RNA