PDF《生物工艺学实验（一）》

生物工艺学实验

(一) 胡佳俊 王锦华 上海大学生命科学学院 二0一八年十月 微生物工程实验室学生实验守则 为了保证实验教学的正常进行, 特订立学生实验守则如下:

一、学生必需在完成预习后,方能进入实验室进行实验.

二、实验时不得大声喧哗和随意走动,以保持实验室安静.

三、听从教师指导,严格按操作规程和实验要求进行实验.

四、加强环保意识,实验废弃物必须存放在指定的容器内.

五、实验记录的数据必须由指导教师签收,实验报告在规定期 限内完成.

六、酸、碱、腐蚀性、有毒有害试剂须正确使用,规范操作, 谨防意外.

七、爱护公物,不随意挪动公用仪器设备,损坏仪器照章赔偿.

八、实验结束后,关闭仪器设备和水、电等,做好安全和清理 工作.

九、注意安全操作,发生意外时立即采取急救措施,并及时报 告教师和有关部门. 目录实验一.淀粉水解糖含量测定…1 实验二.谷氨酸发酵液中谷氨酸含量测定…4 实验三.氨基酸发酵及发酵条件试验…7 实验四.发酵液中谷氨酰胺的分析…9 实验五.离交法分离提取谷氨酸…10 实验六.糖化曲的制备及测定…12 实验七.酒精发酵试验及测定…14 实验八.柠檬酸发酵…16 实验九.柠檬酸的测定…17 实验十.紫外线诱变育种…18 实验十一.NTG 诱变育种…20 实验十二.发酵产品提取的预处理实验…22 实验十三.仿真谷氨酸发酵实验…24 实验十四.实验室发酵罐的操作技术…27 实验十五.降解纤维素的真菌菌种培养…30 实验十六.等电点法氨基酸提取实验…32

1 实验一 淀粉水解糖含量测定 一. 目的和要求 1. 掌握工业生产中使用淀粉制葡萄糖的基本原理. 2. 学习和掌握淀粉水解的工艺流程及其测定方法. 二. 基本原理 淀粉是由数目众多的脱水葡萄糖单位(C6H10O5)n,经由糖苷键缩 合而成的多糖.由淀粉质原料生产葡萄糖,很早以来人们就采用无机 酸(通常用盐酸)为催化剂,在高温条件下使淀粉发生水解反应,转 变为葡萄糖.葡萄糖醛基在碱性溶液中可使高价铜还原成低价铜.当 高价铜量固定时,被样品中葡萄糖还原后,剩下的高价铜可用标准葡 萄糖溶液滴定借以定量样品中的葡萄糖(实际为还原糖总和) . 1. 水解:淀粉包括淀粉、戊糖、半纤维素(主要指多聚戊糖)用盐酸 加水分解转化成还原糖. HCl (C6H10O5)n + nH2O nC6H12O6 2. 中和:将余酸中和至 pH6~7,在碱性溶液中糖会分解,影响分析 结果. 3. 当斐林氏甲、乙液混合时,生成氢氧化铜沉淀. CuSO4 + 2NaOH NaSO4 + Cu(OH)2 氢氧化铜再与酒石酸钠作用 COONa COONa HC-OH HC-O + Cu(OH)2 Cu + 2H2O HC-OH HC-O COOK COOK

2 糖液滴入后铜盐被还原成红色氧化亚铜沉淀 CHO COONa COOH COONa (CHOH)4 HCO (CHOH)4 HCOH +2 Cu + 2H2O +2 +Cu2O CH2OH HCO CH2OH HCOH COOK COOK Cu2O + K4Fe(CN)6 + H2O K2Cu2Fe(CN)6 + 2KOH CHO N (CHOH)4 + + H2O (CH3)2N S N+ (CH3)2Cl- CH2OH 氧化型(蓝色) CHO N (CHOH)4 + + HCl (CH3)2N S N (CH3)2 CH2OH 还原型(无色) 斐林氏溶液全部被还原后,滴入的糖液便与次甲基兰指示剂作用,将 其还原成无色化合物而达终点,为了加速反应,在斐林氏溶液中加入黄血 盐,使反应生成氧化铜红色沉淀变成可溶解状态,加速反应,并使终点由 原来的蓝色转红色变为淡黄色,便于辨认. 此法受操作条件影响很大,如温度高低,沸腾时间长短,pH 高低等 等.为了得到较准确的结果,必须保持操作尽量相对统一.另外,为避免 酒石酸钾钠在强碱溶液中还原铜,影响结果,甲乙液必须现用现混. 三.试剂 1.斐林氏 A 液:CuSO4・5H2O 35g ,次甲基兰 0.05 g 溶解后定 容至

1000 毫升. 2. 斐林氏 B 液:酒石酸钾钠

117 g ,氢氧化钠 126.4 g ,亚铁氰化 钾9.4 g ,各自溶解后定容至

1000 毫升.

3 3. 0.1%标准葡萄糖溶液: 于100~105 o C 烘干恒重而无水葡萄糖称取

1000 毫克加水溶解,并加

5 毫升浓盐酸防腐,定容至

1000 毫升. 此溶液使用期间如发现混浊应重新配制. 四.测定方法 1.称取 1.000 克样品(湿淀粉 1.500 克) ,置于

250 毫升三角瓶中加

100 毫升水,20%盐酸

10 毫升,瓶口装一长玻璃管作为回流冷凝 用,在水浴上加热

3 小时取出放冷,滴酚酞指示剂,用1N NaOH 中和至淡红色,移入

250 毫升容量瓶中定容. 2. 预备滴定:各取甲、乙斐林氏溶液

4 毫升于三角瓶中混匀加热至 沸腾,滴加 0.1%标准葡萄糖溶液至蓝色消失,记下体积数. 3. 空白滴定:各取甲、乙斐林氏溶液

4 毫升于三角瓶中混匀,加入 比预备滴定少

1 毫升的标准葡萄糖溶液,加热沸腾后,继续用标 准葡萄糖溶液滴定至终点. 4. 样品滴定:各取甲、乙斐林氏溶液

4 毫升于三角瓶中混匀,加入

5 毫升转化后的样品溶液,用空白滴定的方法滴至终点. 五.计算方法 (V1―V2)*0.1*0.9 (V1―V2)*4.5 淀粉(%)= = W W *5

250 式中: V1―空白滴定耗去标准葡萄糖溶液的毫升数 V2―样品滴定耗去标准葡萄糖溶液的毫升数 W―样品重量 0.9―葡萄糖折成淀粉的换算系数 六.思考题 1.缩小测定误差的关键是什么? 2.除了利用酸水解葡萄糖外,还有那些常用水解葡萄糖的常用方 法?

4 实验二 谷氨酸发酵液中谷氨酸含量测定 一. 目的和要求 1.了解瓦氏呼吸计的结构以及在工业生产、科学研究上的应用. 2.学习与掌握瓦氏呼吸计的操作技术. 二. 基本原理 瓦氏呼吸计广泛地应用在呼吸作用,光合作用,酶的活性测定等 方面的研究中.其基本原理是在一密闭的一定温度体积的系统中进行 样品中气体变化的测定.当气体被吸收时,气体分子减少,则压力降 低.相反,当产生气体时,则压力上升.此压力的变化,可以在测压 计上表现出来.由此,可计算产生气体或吸收气体的数量. L―谷氨酸脱羧酶专一地催化 L―谷氨酸脱羧,释放出 CO2,每分 子L―谷氨酸产生一分子 CO2,用瓦氏呼吸计测得释放出的 CO2 量, 即可求得 L―谷氨酸的量. COOH COOH CH2 CH2 L―谷氨酸脱羧酶 CH2 CH2 + CO2

37 o C pH 4.8~5.0 CHNH2 CH2NH2 COOH 本实验所用 L―谷氨酸脱羧酶为大肠杆菌丙酮粉. 三. 材料及试剂

(一) 大肠杆菌丙酮粉. 1.将活化的大肠杆菌由试管斜面培养基接种到

10 只200 毫升茄形 瓶培养基上,于37 o C 培养 16~18 小时,培养基的配方如下: 蛋白胨 10g,牛肉膏浓缩液 5g,NaCl5g,琼脂 20g,溶解后混 合,用蒸馏水定容至

1000 毫升. 2.于每一茄形瓶中加入少量 0.9%NaCl 溶液,洗下菌体(可洗二 次) ,菌体悬液离心(2500 rpm) ,弃去上清液沉淀(菌体)悬 浮于少量盐水中,置冰箱中冷却. 3.向已冷却的菌体悬液中加入

10 倍体积的冷丙酮 (-10 o C) 加毕, 剧烈搅拌

10 分钟.静置,待菌体沉淀后,倾去上清液,菌体用 布氏漏斗抽滤.并用冷丙酮洗菌体一次.滤渣置真空干燥器内 减压干燥.所得大肠杆菌丙酮粉装于密封瓶内.冰箱保存,数 月内有效.

(二) pH5.0 3M 醋酸缓冲液,先配制 A、B 液. A 液:称取 NaAc・3H2O 40.8g 溶于蒸馏水稀释至 100ml.

5 B 液:12gHAc 加蒸馏水 100ml. 将A、B 两溶液按 7∶3(V/V)混合即得.使用时最好用 pH 计校正.

(三)pH5.0 0.5M 醋酸缓冲液. 用pH5.0 3M 醋酸缓冲液稀释制得. 稀释后也需要用 pH 计校正.

(四)大肠杆菌悬液. 用pH5.0 0.5M 醋酸缓冲液配成 2%大肠杆菌丙酮粉悬液.

(五)L―谷氨酸被测样.

(六)布洛的(Brodic)氏溶液. 称取 NaCl 23g 及牛胆酸钠 5g,溶于蒸馏水并稀释至 500ml, 再加伊凡兰 0.2g 及麝香草酚溶液数滴.此溶液比重应为 1.033,如 偏低可加 NaCL 调节,偏高可加蒸馏水调节. 四. 操作方法 1.将三套已知瓶常数的测压计的编号填入下表,取下反应瓶,按下表加........