PDF《安神补脑液对睡眠剥夺模型大鼠学习记忆 及脑源性神经营养因...》

硝酸纤维素 膜购自Gloucestemr 公司 ;

Western blotting marker 购自 invitrogen 公司;

Western blotting 荧光剂购自Santa Cruz 公司.

1 .

2 动物以及分组

75 只SD 大鼠, 雄性 ,体重

250 ±

30 g ,购于北京维通利华实验动物中心, 合格证 号:SCXK( 京) 2002-

003 .每次购进

25 只大鼠 ,在SPF 级动物房适应性饲养

1 周后 , 随机分成 : 正常对照 组、正常对照 + 补脑液小剂量组 、模型 +蒸馏水组、 模型 + 补脑液小剂量(

0 .

2 ml 人体用药原液

100 g) 组、模型 + 补脑液大剂量组 ,每组

15 只, 分3批进行 ・

1230 ・ 实验.按人 - 大鼠等效剂量换算法 ,补脑液小剂量 (

0 .

2 ml 人体用药原液

100 g 体重) 相当于成人每日 用量, 大剂量(

0 .

6 ml 人体用药原液

100 g 体重) 相 当于成人每日用量的

3 倍, 正常对照和模型组给等 量的蒸馏水.各组每天分别灌胃给药或蒸馏水

1 次,给药

2 周后进行实验造模,造模以及行为学测试 期间仍继续给药 .

1 .

3 造模方法 睡眠剥夺箱参考巴西 Hipolide 等[5] 的多站台水环境法 , 委托中国医学科学院药物 研究所加工制成 .水箱规格 :

127 cm( 长)*44 cm ( 宽)*44 cm( 高) , 其内放置

13 个站台, 站台高

20 cm,上面直径

7 cm .实验造模时以水面至站台 下1cm ,将需睡眠剥夺大鼠放入睡眠箱 ,每箱放入

10 只, 正常对照组以及正常对照 +补脑液小剂量组 保留在放在同一实验室内的笼内.各组动物自由进 食和水,前后经历

4 d ,进行避暗行为学实验 .

1 .

4 避暗测试 研究报道鼠长时间睡眠剥夺可以 出现记忆存留障碍 [ 5] .避暗测试参考以往的方法有 所改动 [ 6] ,装置分明暗两间 , 明室上方置一

40 W 白 炽灯, 暗间底部设有

40 V 电网 , 两室间有一直径

3 cm 圆孔相通 ,并有活动板隔开.箱外连接一计算 机采集数据 .测定分

2 d ,d

1 将大鼠背对洞口放入 明室,

10 s 后将中间隔板打开,等动物全部进入暗室 后,将隔板关上 .之后每隔

15 s 给1次1s的电刺 激,总共

4 次电击 .将大鼠取出暗室 ,放回笼内休息

24 h .d

2 ,重新将动物放入明室 , 记录动物自放入 明室至完全进入暗室所需要的潜伏期.

1 .

5 脑源性神经营养因子表达测定 行为学实验 后再按造模期间方法将鼠放入剥夺箱 ,

24 h 后以

10 %水合氯醛过量麻醉处死 ,在冰冻条件下快速分 离海马组织经液氮转入-80 ℃冰箱保存.每组随 机取

3 只大鼠海马 , 以1∶5 匀浆液(

0 .

05 mol・L -1 Tris-HCL) 处理后高速匀浆 ,12

000 *g 离心

1 5 min , 取上清 .Folin 酚法测定蛋白浓度, 常规制备

12 %分 离胶, 上样, 转移到硝酸纤维素膜 ,加入脑源性神经 营养因子( BDNF) 多克隆抗体( 兔抗大鼠

1 ∶500) , TBST 洗膜

3 次, 加二抗 ,TBST 洗膜

3 次, X 光片曝 光,显影.用NIH 的ImagJ 软件进行图像分析, 测量 各组大鼠海马 BDNF 表达条带的面积与平均光密度 计算平均光密度总合 ,并以正常对照组均值为参照 , 比较各组 BDNF 的表达量.计算公式为 : 平均光密度总合 =条带面积 * ( 条带光平均密 度-背景平均光密度)

1 .

6 统计学处理 实验结果以均数 ±标准差( x ± s) 表示 ,用SPSS 统计软件单因素方差分析( One- way ANOVA) 法进行组间比较 , P