PDF《近交系五指山小型猪骨髓间充质干细胞分离培养及生物特性》

细胞表面抗原由美国BD公司的FACScanto6流 式细胞仪检测,吸光度值均由酶标仪X-Mark检测. 1.2.1 骨髓采集 3%戊巴比妥钠按1 mL/kg腹腔麻醉;

起效后将 猪侧卧位置于无菌操作台上,备皮、消毒、铺巾. 带无菌手套后用18号骨穿针在距髂骨翼边缘1 cm处 垂直旋转进针,进针约1.5 cm时有轻微突破感,拨 出针芯,接20 mL肝素化的注射器,匀速抽取骨髓 液5 mL;

插上针芯,取出穿刺针,局部消毒按压 约2 min,予穿刺点周围肌注青霉素40万U,将猪送 回猪笼、隔离,待麻醉醒后正常饲养. 1.2.2 BM-MSCs 分离培养 将采集的骨髓血用DPBS以1:4的比例稀释,然 后准备2个50 mL离心管,每管中盛入15 mL猪骨髓 间充质干细胞分离液.然后将骨髓稀释液按1:1的 比例缓慢加入到干细胞分离液上层,1?

200 r/min 离心30 min后,用巴士吸管将含有单个核细胞的 淡黄色云雾状液体层吸出,移至另一个50 mL离心 管.加入15~20 mL DPBS,混匀后800 r/min离心

30 min,弃上清.重复操作2次.弃上清,用1 mL 细胞完全培养基重悬细胞颗粒,常规计数后以4*103 ? cm ?2 密度接种到直径60? mm的细胞培养皿 中,然后置于37 ℃,5%CO2及饱和湿度的培养箱 中培养;

以后每隔3 d换液1次.在第9天左右,细 胞融合度达到70%~80%,可用于传代.用0.25%胰 酶........