PDF《pGEM-T?/pGEM-T? Easy Vector Systems》

pGEM-T?/pGEM-T? Easy Vector Systems 简明操作指导 注意:这是节选操作步骤,详细英文说明书见 www.

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网址:www.promega.com II. 操作步骤: 下面的操作步骤为简化操作指导,更多信息请参考pGEM-T?/pGEM-T? Easy Vector Systems中文操作说明书. Quick PROTOCOL I. 说明: pGEM?-T 和pGEM?-T Easy 载体系统可用于PCR 产物的克隆.这两种载体是通过EcoRⅤ酶切pGEM?-5Zf(+) 和pGEM?-T Easy 载体,并在3'末端加入胸腺嘧啶构建的.插入位点3'-T 突出端可提高PCR 产物的连接效率,因为3'- T 突出端可以防止载体的自身环化,并且为热稳定性聚合酶(1,2)产生PCR 产物提供一个匹配碱基. 配制连接反应系 统.室温孵育1 小时或4oC孵育 过夜. 冰上融化感受态 细胞.取50μl细 胞加入至2μl连接 产物里.冰上孵 育20分钟. 42oC热休克 45-50秒 冰上孵育2分钟 添加SOC培养 基.37oC摇动 孵育1.5小时 铺板.挑取白色 克隆. III. 连接反应(使用2X Rapid Ligation Buffer)操作步骤 1. 短暂离心含有pGEM?-T Vector或pGEM?-T Easy Vector 和Control Insert DNA的离心管,收集内容物至管底. 2. 按如下表格配制各个连接反应体系.每次使用前都要用力涡旋2XRapid Ligation Buffer.使用0.5ml的DNA低吸附离心管. 注意:2 x Rapid Ligation Buffer含有 ATP,在温度波动时 ATP 易降解,导致连接效 率下降.可在第一次化冻后,将缓冲液按单次用量分装到小管中,-20℃保存,这样 可避免反复冻融及经常的温度变化. 3. 吹打混匀反应体系.室温孵育1小时,或者4oC孵育过夜(可获得最大的连接 效率). 试剂 标准反 应 阳性对照 背景对 照2X Rapid Ligation Buffer, T4 DNA Ligase 5μl 5μl 5μl pGEM?-T或pGEM?-T Easy Vector (50ng) 1μl 1μl 1μl PCR产物 Xμl ― ― Control Insert DNA ― 2μl ― T4 DNA Ligase (3 Weiss units/μl) 1μl 1μl 1μl 去离子水 (3-X)μl 1μl 3μl 终体积 10μl 10μl 10μl 简易流程图 Quick PROTOCOL 普洛麦格(北京)生物技术有限公司

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网址:www.promega.com pGEM-T?/pGEM-T? Easy Vector Systems简明操作指导 IV. 转化JM109 高效率感受态细胞操作步骤 1. 准备LB/ampicillin/IPTG/X-Gal培养板. 2. 短暂离心连接反应体系.吸取2μl的连接反应体系至一1.5ml无菌离心管中,离心管事先置于冰上.同时准备一个 对照离心管,内含0.1ng完整(未经酶切的)质粒,用来确定转化效率. 3. 将JM109 高效率感受态细胞置于冰上至细胞刚融化(5分钟),轻弹离心管混匀细胞. 4. 小心转移50μl细胞至步骤2准备的含有连接产物的离心管里.对于完整(未经酶切)质粒的对照,使用100μl细胞. 轻弹混匀,冰上孵育20分钟. 5. 42oC水浴热休克细胞45-50秒(不要摇动).之后立即将离心管放回冰上,放置2分钟. 6. 添加950μl室温SOC培养基至连接转化体系里,添加900μl SOC培养基至完整(未经酶切)质粒的对照里.37oC 摇动(~150rpm)孵育1.5小时. 7. 取100μl转化培养物铺至LB/ampicillin/IPTG/X-Gal培养板上,并设置二重复.对于完整(未经酶切)质粒的对照, 建议将培养物1:10稀释后再铺板. 8. 37oC过夜孵育培养板.挑取白色克隆. ? 含有ampicillin/IPTG/X-Gal的LB平板 ? SOC培养基 需自备的材料