PDF《病毒学杂志》

病毒学杂志 一 某些植物病毒核糖核酸 '

末端 样结构 '

蒋秉坤蚌埠医学院 , 虾埠,,

.

夕,为提要按照直接化学定 序法 测定了某 些 植物病毒 , , 和'

末端区域的核背酸顺 序.基于核普酸顺 序资料参照 一模型等,提出它们 '

末端内可 能二 级结构,即一样结构.、、、和一'

末端的 一样结构 完全 一致.此种对颧 氨酸 具 有特异 性的 一样结构 与真 核生 物颧 氨酸也极 为相似 . 颧氨酸反 密码 子位于一样结构 的适当部位 . 这些 植物病毒 的 核普酸 由于 硷基 配 对在 氨基 酸接 受 臂内 能 产生 个硷基 对的共轴堆砌 . '

末端区域具有 … … . 末端 . 本 实验 结果 支持 等 年提 出的 一'

末端二 级结构模 型.最后简要 地 讨论 了一样结构 的可 能 作用 . 某 些植物病 毒核 糖核 酸'

末端 区域能被很 多特异酶所 认识,故具有 样 性质 . 和 首先提 出芜 普黄花叶 病毒 , '

末端存在 一 样结构 一〔 , . 以后 又在 许多植 物病毒和 某些 动物病毒 川 发现 了这 种结构,和等曾作过详细评 述'

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. 人们推测病 毒的样片段 和分子之 间的结构必然十分 相似 . 然而 , 当'

末端 片段 的核 普酸被 阐明 之后 发现 两者 有很大差 异.具有不 同 的一 级 和二级结 构 的两 种核酸分 子,例如和某些 病毒 能被同一个酶 系统 一特异酶 所认 识,这在遗传信 息 的传 递上必将具有 重要 的作用 . 蝶豆黄脉病 毒,、黄花叶病毒 , 、 安第斯马 铃薯隐潜病毒 , 、 芒 柄花黄叶病毒 , 和茄子花 叶病 毒,是植物病毒芜善黄花叶病毒 组的五个成员 . 它们 为直 径和呈二十面 体 的颗粒 . 病毒 基 因组 约含.个核 普酸 , 分子量为 道尔顿 . 已经 查 明有 种病毒属于 这个组 , 其典型代表 是 芜蓄黄花叶 本文于 年月日收 到 此文 曾在 年于 烟 台举 行 的全 国病毒生 化研究 讨会议 上宣读.?1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 病毒 学杂志,日病毒 〔 〕 . 两组科 学 家几乎 同 时独立地分 别发表 了'

末端片段 和 个核 普酸的排 列顺序并提 出 少许 不同的可能 硷基配对即二级 结构 〔 '

. 等 根据 化学修 饰和 酶消化的研 究结果提 出'

末端 的样结构模型 . 〔 , 提出'

末端 个核 普酸组 成的一样结构模型 图.我们应用化学定 序 的方 法对芜 著黄花 叶病毒组 的 另外五个成 员基 因组 '

末 端片段 的结 构进行 了研究 . 这 项实 验结果 的一部分 曾在 阿姆斯特 丹 第十三 届国际生物化学代表 大会上提 出年月...・..'

二 二又.、尸勺等八・,,

兀韭图根据化学和 酶 消化 方法等提出的 , 末端一样片段 的二 级 结构模型 . 一,工,材料与方法材料 实 验所 用 的植 物病 毒由 ,博士赠 送.一核普酞转 移酶 . . . 按照'

等〔,介绍的方 法从酵母 细胞 中分 离.一一居里.二甲硫 酸醋 , . 麟.硼氢化钠 . 焦磷 酸二 乙脂 , , 丙烯酸胺 , 甲叉 双 丙烯 酸胺和 . ? 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 病毒学杂志 谊方法病毒核 酸 的提取 声病毒制剂约加加声'

以水饱 和酚 溶液和 川. 乙酸钠 在微离心管 内混合 , 高速台式离心机 离心 约分钟.移去 上 层水相 , 再同样用 砂酚抽提一次 . 合并两次酚相 , 加入川 】乙酸钠 抽 提一 次.两次水相 合并后加 倍体积 川冷乙醇 , 混 匀后 置一℃小时,离心 弃上 清液 . 如此重复一次 , 沉淀 物 真空 干燥 , 砂双蒸水溶解 一郑川贮于一℃备 用.病毒'

末端标记和 纯化 声病毒溶液和 那一一微居里加于微离心管 内,离心和 真空 干燥 . 加川倍浓度'

一核普酞转移 酶缓冲液 甘氨酸 氢氧 化钠,氯化镁 和户,一核普酞转 移酶 溶液 , 混合 . ℃过夜约小时 . 加川样品缓 冲液 , 混匀,℃水溶保 温分钟.聚丙烯 酞胺 凝胶 火预电泳 小时.上述标 记样品点样后 了 电泳 小时,当嗅酚 兰 染料移 到 凝胶 板底 部时切 断 电源 . 放射自显影后 用 清洁 手术 刀切 下所 需 的放射性 凝胶 区带.以适 量 乙酸钠 溶液 洗脱 , 倍 体积 冷乙醇沉淀 , 真空干燥后 溶于适 量双蒸馏水 中,贮于 一 ℃冰箱 供顺 序 分析用 . 化学修饰直 接定序 根据〔'

., 介绍的化学修 饰直 接定序 的方 法把 样品分装在支微 离心管 内分 别进行 四 种不 同硷基特 异 性化学修 饰反 应.修饰鸟普,主要攻击 腺普 . 脐 攻击尿 普 和胞 普,但氯化钠 抑制与的反 应,在此情况下 反应 占优 势.经上述 四 种修 饰 反应 后用苯胺对 进行链切反应 . 通过聚丙烯 酞胺凝胶 电泳 , '

末端标记 的长 短不 同的片段便 可分 离,经放射 自显影后 即可直 接读出它 的核 普酸顺 序.为了测 定病毒'

末端 一样片段 的核 普酸顺 序,一般可 选用'

末端 标记 的 个核 普酸长度 的片段 较好 . 较大 的片段 在处理 上有 困难 , 而 较小 的 片段 可能会有宿主 的污 染.结果与讨论病毒 '

末端标记反 应产物经聚丙烯 酚胺 凝胶 电泳和放射自显 影 的结 果如 图.是含有 个核 普 酸的 片段 作为核 普 酸片段 长度 的标志 . 工、亚、和万为长度 在一个核 普酸的长短不 同 片段 , 洗脱 和纯化后 供顺 序 分析 用.病毒基因组 约含个核 普酸 , 因其自发性 降解反 应产 生一 系列长短不 同的片段 , 可选 用适 当长度 的片段 而不 必 再用 核糖 核 酸酶 处理 . 芜 首黄花 叶病 毒 具有 … '

末端 , 这 样无 需作任何处理便可直接在一核普酞转移酶 的催化下 用一 一进行'

末端 的标记 , 获得含有 '

末端 标记的 , 反应 如图.应用'

末端标记 作化学修 饰定 序反 应 时还存在 某些 问题,即嗜咤反 应 的带 谱模 糊不 清难 以定 位.顺序分 析 的直 接 化学定 序 的放 射 自显 影 图谱 作为我们 一 系列 研 究的一个例子 图.由四 种 化学修 饰反 应 反应 、 反应、反应和反应?1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 病毒学杂志 , 如一蕊皿企'

二图病毒用一一人和一核普酞 转移酶进行标 记.在含 有 尿素 的 肠聚 丙烯疏胺 垂 直扳胶上 进行电脉 含有 '

末端的病毒 降解 产物用放射 自显 影检查 是作为标 志物的 人 片段 . . 五一之一....七.. , , 肠改.,吕一'

口,'

,盆,五・五所引起 的链切 结果 在同一个 凝胶 的放射 自显影 图谱上很容 易 读出它 的核 普酸排列 顺序 . 在图的胶电泳 的放射 自显影 图谱 中可 以读出从 '

末端第共个核昔酸 的 顺序 〔 '

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〕 . 其 中最 引人 注意 的是反 密码环 的 顺序 的带 谱.如果改变凝 胶 的浓度 可 以较方便地 辨认 个核普酸 以 内的核普酸顺 序,用较低浓 度 的胶 和 延长 电泳分离的时 间可对长度在 个核普酸的顺 序 进行 鉴定 . 因为 顺序 ? 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 月稀学杂志 , 色通注一叙―'

核件肤转移酶 、 伙、人,、尸、、认,、甲'

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,用一一和,核普酞 转 移酶 标记病毒箭头指示酶作用部 位.星号代表一一一作匕图￡一.了 记刀少功 士孟,叹'

之、. 么一,表某些芜蔺黄花叶 病毒 '

末端 片段 '

幼】丁口 几健续表 仆人和的一 部分先前已经 发表 '

别.未鉴定碱 基用 表示 '

五一一主,么汀.功 了 ?1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 病毒学 杂志 , 均合 奋三'

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・几的研究在极微量 的水平上进行和 操作步骤繁杂等缘故一般需 要反复多次实验 , 即使这样 有时对某 些 区域 的碱基顺 序仍不 能最后 确定 . 因此 , 一 有时尚需要应用酶消化定序 方法 来 协助明确某 些碱基 的顺序 . 例如的叭 几吼'

三个碱基 的带 谱在化学方法 中 很模糊 , 但当用对 鸟普有特 异性的 消化时叭 气吼部位的带谱十条清晰 结果在本文 中末指 出.六种 病毒 '

末端 片段 的核普酸顺 序 资料汇集于表 . 图'

末端顺 序分 析应用对 和残基特异 性 化学反 应.'

斑万,、五几几根据 顺序分析所获得的资料按 照配对雨廊响以折 迭辰二病构,一即一样结构,作为 一个例子 图是参照 王的模型 进行折迭的'

末端一样结 构.?1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 病毒学 杂志 , 台玉,、・'

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・一了艺邻 饥图'

末端一样结 构工、亚、和万代表四个发夹样结 构 编号 从'

末端开 始.方框区域为反密码子.一'

,亚,己开刀七之'

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,吮多 一样结构和第一 次证 明 的基 因组 在领 氨酸 一 合成酶 的催化下 与颗氨酸 结合 . 以后 烟 草花 叶病毒 和雀麦花 叶病 毒的'

末端 也能特 异性地 接受 氨基 酸,和已有详细评 述〔 '

〕.一般说 来属 于 同一 组病 毒 接受相 同 的氨基 酸.病毒 除与氨基 酞一合成酶 有关外 , 还和其它一 些特异酶 有关系.如一核普酞 转 移酶 , 一 甲基 转移酶 , 延长因子 一和一以及肤 基一,水解酶 等〔〕,这些资料表 明病毒末端存 在着的性质和 结 构特 点,这也正是 称 它们 为一样结 构 的原 因.和〔已'

了'

对'

末端 一级结构研 究发 现这些 核 普酸 的顺 序 并不 折迭成已知典型 三叶草 结构 , 而且 还缺乏构成 特征的稀 有碱基.〔,根据 化 学修 饰和酶消化 的方 法提 出'

末端一样结 构模 型图.我们研究 的五种 病毒 参照 的模型 折迭,其结果它们 均呈 十分相似的一样结 构图.从此二级结 构模 型可 以看到它们 有如 下 共同特 征.和典型 的 三叶草 结 构不 同 的是 它们 有发 夹工区域 , '

末端不参与一样结构的组成病毒 '

末 端片段 碱 基顺 序彼 此差 另很大并有许 多碱 基取代 一 样结 构与'

丫吕'

结构的共 同特 点是 它们无 例外地有 … … . , '

末端 的碱 基顺 序,氨基酞化作 用发 生在其末端 病毒'

末端 片段 的发 夹亚、和相当于典型 的劝,反密码 子和 双氢尿 嗜 咤环和 干.在所研究 的芜 ? 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 病毒学杂 志,,

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