PDF《Genloci pGK1.0(Neo ) vector》

测序验证序列;

质粒大 提;

电转染靶细胞. 在细胞内 crRNA 识别靶位点, Cas9 对靶位点进行随机剪切. Cruiser? 酶切细胞池, 计算突变率;

Cruiser? 酶切初筛阳性克隆;

将阳 性克隆测序验证;

做敲除序列比对 分析. U6 CACCG CAAA

1 2

3 4

5 5'

-5'

3'

-3'

- - ~20bp Genloci pGK1.0(Neor ) vector Protocol No. PT161214-4 www.genloci.com Genloci Biotechnologies Inc. 5/9 IV. 操作步骤 实验前,请您务必做好以下验证实验: A.单细胞生长情况,确保单个细胞可以正常生长形成单克隆,即,低密度的细胞在培养皿中可以 形成单克隆. B. 目的基因的表达情况分析,为防止因染色体缺失等情况导致靶基因缺失,首先需要 PCR 扩增靶 基因,并对 PCR 结果进行测序,确保靶基因的完整存在;

其次,您还可以用 RT-PCR 分析靶基 因的活跃度. 1. 设计 Oligo DNA 序列 首先,您需要在靶标 DNA 区域中设计一对 20bp 左右的 oligo DNA,您可以通过以下在线工具设计: 麻省理工学院的 CRISPR Design:http://crispr.mit.edu/ 德国癌症研究中心的 E-Crisp:www.e-crisp.org/E-CRISP/designcrispr.html 下面我们选择麻省理工学院的 CRISPR Design 工具来做设计举例,以human Fut8 基因为例,一次只 能输入大小为 23~250bp 的基因片段,最好一次只输入一个外显子,避免 Guide 序列跨内含子的. 点击 Download as genbank 按钮,出现以下界面: 根据左边的 score 的高低选取合适的 Guide 序列,score 的高低并不代表敲除效率的高低, 所以为提高 敲除的成功率,一般选择 2~3 个Guide 序列,构建 2~3 个敲除载体.后续先在 pool 细胞的基础上验证出 有效的位点,再拿此位点做正式电转,筛选单克隆.以Guide#1 序列为例,2 条单链 oligo 的序列如下(小 写字体部分是要分别与 BbsI 或BpiI 酶切后的载体相互补的部分) : Fut8-F: caccGAATGAGCATAATCCAACGCC Fut8-R: aaacGGCGTTGGATTATGCTCATTC 注意:设计 oligo DNA 序列时 Guide 序列第一个碱基必须是 G,如果你选取的 Guide 序列的第一个碱基不是 G,应自行加 一个 G 上去,相应的下游引物序列互补的位置为 C(如绿色标注碱基 G/C) . Genloci pGK1.0(Neor ) vector Protocol No. PT161214-4 www.genloci.com Genloci Biotechnologies Inc. 6/9 另外, 需在位点上下游各设计一条引物, 用于后续 PCR 或测序检测阳性克隆, 引物能扩增约 300-500bp 的DNA 片段,上下游引物距突变位点约 100-400bp. 将设计后的序列送到值得信赖的公司合成,纯化级别为 PAGE. 2. pGK1.0(Neor ) vector 线性化处理 BbsI 或BpiI 单酶切 pGK1.0(Neor ) vector,胶回收约 9kb 的条带. 3. T4 DNA Ligase 连接 将合成后的

2 条单链 oligo DNA 稀释成

10 μM,先变性再退火形成 dsDNA,后与载体连接,反应体系 如下: 正链 Oligo(10μM) 5μl 负链 Oligo(10μM) 5μl ddH2O 8μl Annealing Buffer(10x) 2μl Total Volume 20μl 将以上体系瞬时离心后,置于 PCR 仪中 95℃孵育 3min,孵育后自然冷却 20min.进行 DNA Ligase 连 接反应,10μl 反应体系载体的添加量为 40ng,杂交后的 dsDNA 添加量为 1μl. 连接产物可以直接转化大肠杆菌高效感受态细胞,转化和筛选阳性克隆的实验步骤请您参考《分子克 隆实验指南》 ,pGK1.0 的抗性为卡那霉素抗性,使用上游引物 VSP primer(Tm=56.7℃)与下游负链 Oligo 引物进行菌落 PCR 筛选,阳性克隆 PCR 正确大小应为

100 bp,筛选到阳性克隆后,需使用 VSP primer 测序验证序列的正确性. 注意:VSP Primer:5'