PDF《产品说明书》

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3 US EVERBRIGHT? INC.

技术支持: 0512-88965152 www.useverbright.com 产品说明书产品名称:Sulfo-Cy7-E, SE [ Sulfonic Cyanine 7, succinimidyl ester] 产品货号:C5070 产品规格:1 mg 应用范围:荧光标记染料 产品参数 外观:可溶于水、DMSO 或DMF 的绿色固体 Ex/Em: 747/774 nm 贮存条件:-20℃避光保存 保质期:12 个月 分子量:818 消光系数:200,

000 可用于直接替代:Alexa Fluor 750, DyLight

750 等 产品介绍 菁染料是性能优良的荧光标记染料,摩尔吸光系数在 荧光染料中是最高的, 其琥珀酰亚胺酯是最常用的脂肪氨基 标记试剂,广泛用于蛋白、抗体、核酸及其他生物分子的标 记和检测.通过改变次甲基链的长度, 可改变其荧光发射波 长,每增加一个双键,按照 Huoffman 规则正好红移约

100 nm. 水溶性菁染料 Cy3 和Cy5 已成为基因芯片的首选荧 光标记物;

另外,Cy5, Cy5.5 和Cy7 的吸收在近红外区背 景非常低,是荧光强度最高、最稳定的长波长染料.特别适 合于活体小动物体内成像代替放射性元素. 菁染料和生物分子的比例 F/P=4~12 之间荧光强度最 高, F/P 值过高荧光探针会自我淬灭并影响生物分子的生 物活性,标记生物分子最好是用单琥珀酰亚胺酯, 但是用双 修饰的 CyDye SE 并没有发现交联.CyDye SE 标记抗体在 pH (8.5~9.4)时10 分钟 F/P 可达 5~6,而在 pH 7.0 几乎不 反应. 我们用不同比例的 Cy3 标anti-glutathione-S-transferase (GST)多克隆抗体发现用 1:1, 5:1, 10:1 和20:1 标记时得到 的F/P 值分别是 0.28:1, 1.16:1, 2.3:1 和4.6:1. 操作方法 1.水溶性 Cy5 SE 标记 (D-ser2)-leucineenkephalin (1)Cy5 SE 1.0 mg 溶解于

400 μL 无水 DMSO 后,加入 到1mL 的玻璃瓶中,其中盛有

400 μL 无水 DMSO 溶解的 (D-ser2)-leucineenkephalinacetate .(Dye 和peptide 投料比 是1:1). (2)加入

15 μL 三乙胺,常温避光搅拌反应混合物过夜. (3) 用HPLC 纯化蛋白, 使用蛋白 C18 柱子(25 cm*

10 mm), 每次上样注入 2*400 μL,30 min 梯度洗脱从 0.1%TFA 水溶 液到 MeCN∶H2O(0.1% TFA)=70∶30,流速

4 mL/min.(对 不同的蛋白选择不同的合适 HPLC 梯度流动相). (4)收集适当的色带峰,标记多肽的保留时间比未标记的 多肽长. (5)产品冷冻干燥成粉末或在水溶液中,-20℃避光储存;

必要时可用质谱表征. (6)Cy Dye 标记的蛋白稳定性取决于蛋白本身.例如标记 的IgG 在4℃可避光保存

2 月;

更长期的保存需加入等体积 的甘油-20 ℃避光保存. F/P 计算: Cy5 在650 nm 的摩尔吸光系数为

250000 M-1 cm-1 ,所用蛋 白在

280 nm 处的摩尔吸光系数为

170000 M-1 cm-1 ;

Cy5 在280 nm 处的吸收是

650 nm 处的 5%.按以下公式计算 F/P 菁染料琥珀酰亚胺酯(Cy Dye SE)的标记

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3 US EVERBRIGHT? INC. 技术支持: 0512-88965152 www.useverbright.com 值. [Cy5 dye] = (A650)/250000 [peptide] =[A280 -(0.05* A650)]/170000 F/P final= [dye]/[peptide] = {0.68* A650}/ {A280 - (0.05* A650)} 2. 水溶性 CyDye SE 标记 OLIGO 氨基封端的 OLIGO 可以标记 CyDye SE,但是非常困难, 标记前因为 OILGO 经氨水脱保护,请务必洗涤掉所有的残 余氨水.然后将样品真空干燥;

然后溶于 0.25 ml 的0.5 M NaCl 溶液中,用Sephadex G-50 脱盐,用5.0 mM borate 缓 冲液平衡到 pH=8.0,然后用以上硼酸缓冲液冲下 OLIGO. 然后浓缩至干的样品溶于 0.1 M carbonate buffer (pH 8.5-9.0);

在0.5mL 碳酸缓冲液中

30 nmoles 的OLIGO 加入到 CyDye SE 的玻璃瓶中室温避光,密闭搅拌反应 60min.反应物经 Sephadex G-50 或RP-HPLC 过柱纯化,冷冻干燥后避光保 存. 注意:Oligonucleotides 和oligopeptides 由于太小经常 会留在过滤膜上或在冻存管内贴壁成膜,而无法标记. 3.活体成像领域 SPF 级BALB/C 裸鼠,6~8 周龄, 18~20 g, 实验前