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44 中国实验动物学会团体标准T/CALAS x―201x 实验动物 大鼠泰勒病毒检测方法 Laboratory animals - Methods for detection of rat theilovirus (征求意见稿) XXXX - XX - 发布 - XX - XX 实施 中国实验动物学会 发布T/CALAS XXXXX―XXXX

1 前??言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则编写. 本标准附录 A 为规范性附录. 本标准由中国实验动物学会归口. 本标准由全国实验动物标准化技术委员会(SAC/TC281)技术审查. 本标准由中国实验动物学会实验动物标准化专业委员会提出并组织起草. 本标准主要起草单位:广东省实验动物监测所. 本标准主要起草人: xx,xx. T/CALAS XXXXX―XXXX

2 实验动物 大鼠泰勒病毒检测方法

1 范围 本标准规定了实验动物大鼠泰勒病毒检测方法. 本标准适用于实验动物及其产品、 细胞培养物、 实验动物环境和动物源性生物制品中大鼠泰勒病毒 的检测.

2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的. 凡是注日期的引用文件, 仅所注日期的版本适用于本文 件.凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件. GB

19489 实验室 生物安全通用要求

3 缩略语 下列缩略语适用于本标准. CPE 细胞病变效应(cytopathic effect) Ct 值 荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数(cycle threshold) ELISA 酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay) IFA 免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay) PBS 磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline) PCR 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction) RNA 核糖核酸(ribonucleic acid) RT-PCR 逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction) RTV 大鼠泰勒病毒(rat theilovirus) 实时荧光RT-PCR 实时荧光逆转录-聚合酶链式反应(real-time RT-PCR)

4 生物安全措施 实验操作及处理按照GB 19489的规定,由具备相关资质的工作人员进行相应操作.

5 酶联免疫吸附试验(ELISA) 5.1 检测方法原理 包被于固相载体表面的已知抗原与待检血清中的特异性抗体结合形成免疫复合物. 此抗原抗体复合 物仍保持其抗原活性,可与相应的第二抗体酶结合物结合.在酶的催化作用下底物发生反应,产生有色 物质.颜色反应的深浅与待检血清中所含有的特异性抗体的量成正比. T/CALAS XXXXX―XXXX

3 5.2 试剂和材料 5.2.1 特异性抗原 用RTV 感染 BHK21 细胞,当病变达+++~++++时,收获培养物.冻融三次或超声波处理后,低速 离心去除细胞碎片,上清液再经超速离心浓缩后制成 ELISA 抗原. 5.2.2 正常抗原 BHK 细胞冻融破碎后,经低速离心去除细胞碎片而获得的上清液. 5.2.3 阳性血清 自然感染 RTV 的抗体阳性血清,或RTV 抗原免疫清洁或 SPF 大鼠所获得的抗血清. 5.2.4 阴性血清 确诊无 RTV 感染的大鼠血清. 5.2.5 酶结合物 辣根过氧化物酶标记羊或兔抗大鼠 IgG 抗体;

或辣根过氧化物酶标记葡萄球菌蛋白 A(SPA) . 5.2.6 其他试剂 包被液、PBS、洗涤液、稀释液、磷酸盐-柠檬酸缓冲液、底物溶液、终止液等,依附录 A 自行配 制. 5.3 仪器和设备 5.3.1 酶标仪 5.3.2 恒温培养箱 5.3.3 聚苯乙烯板:40 孔、55 孔或

96 孔(可拆或不可拆). 5.3.4 微量移液器(1~10μL,10~100μL,100~1000μL). 5.4 操作步骤 5.4.1 待检样品 采集大鼠血液,分离血清,血清必须清亮、透明、不溶血,-20℃保存或立即检测. 5.4.2 包被抗原 根据滴定的最适工作浓度, 将特异性抗原和正常抗原分别用包被液稀释. 加入酶标板, 每孔 100μL, 置37℃孵育